五味子甲素对MPP+致SH-SY5Y细胞ERK信号转导通路的影响

李 妍 ， 张 巍 ， 蔡同建 ， 赵东海 ， 罗 军 ， 吕士杰

(1.吉林医药学院基础医学院，吉林 吉林 132013；2.中国人民解放军第三军医大学军事预防医学院 ， 重庆 沙坪坝 400038)

五味子甲素对MPP+致SH-SY5Y细胞ERK信号转导通路的影响

李 妍1， 张 巍1， 蔡同建2， 赵东海1， 罗 军1， 吕士杰1

(1.吉林医药学院基础医学院，吉林 吉林 132013；2.中国人民解放军第三军医大学军事预防医学院 ， 重庆 沙坪坝 400038)

通过体外培养SH-SY5Y细胞，Tunel法观察五味子甲素(Schisandra A，SchA)对MPP+染毒SH-SY5Y细胞形态的影响；激光共聚焦显微镜观察各组细胞核的变化；Western-Blot检测各组SH-SY5Y细胞中ERK及p-ERK蛋白表达水平的不同，探讨SchA对1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion,MPP+)引起的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡及ERK信号转导通路的影响。结果发现，与正常对照组相比，1mmol/L MPP+染毒可引起SH-SY5Y细胞形态明显改变，凋亡细胞明显增多；各浓度组 SchA干预均可有效抑制SH-SY5Y细胞的凋亡。与对照组比较，MPP+组细胞中p-ERK蛋白表达明显抑制；而与MPP+染毒组相比，SchA干预组p-ERK蛋白表达明显升高(P<0.05)，且呈剂量依赖效应。结果表明，MPP+具有促进SH-SY5Y细胞凋亡的作用，而SchA能明显缓解MPP+引起的SH-SY5Y细胞凋亡，该作用可能与ERK信号转导通路活性改变有关。

MPP+； 五味子甲素 ； 帕金森病细胞模型 ； 凋亡 ； ERK

五味子甲素(Schisandra A,SchA)是从我国传统中药五味子中提取的一种木脂素类生物活性物质，是五味子的主要药理活性成分之一[1]。近年来的研究结果显示，五味子木脂素具有广泛的中枢神经系统调节功能[2-3]。刘絮等的实验结果显示，五味子木脂素可通过γ-氨基丁酸受体(γ-aminobutyric acid，GABA-R) 而发挥显著的抗焦虑作用[4]。夏楠等研究发现，五味子能够增强机体的抗氧化作用，有效降低机体的应激反应[5]。谢云亮等进一步通过实验证实，五味子木脂素能够抑制脑组织的脂质过氧化损伤，从而恢复中枢神经细胞的正常功能[6]。此外，有研究结果显示，五味子木脂素中的五味子乙素对帕金森病模型细胞及动物模型均具有明显的保护作用，可提高细胞的增殖能力，并降低细胞的凋亡水平[7]。

我们之前的研究发现，五味子木脂素的主要成分SchA能够促进帕金森病模型细胞的增殖，减轻细胞损伤[8]。本研究在前期实验的基础上，进一步研究SchA对帕金森病模型细胞凋亡水平的影响，并初步探讨其相应分子机制，为SchA药理活性研究的完善提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院； MPP+为美国Sigma公司产品；SchA，中国药品生物制品检定所生产；Tunel试剂盒，购自美国Roche公司；AO/EB染料，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司产品；细胞培养箱，北京东方安若生化科技有限公司生产；倒置显微镜为日本奥林巴斯有限公司生产。

1.2 细胞培养 SH-SY5Y细胞在含10%体积分数胎牛血清，并含双抗的DMEM高糖培养基中贴壁生长，将细胞培养瓶置于37 ℃、含5% CO2的条件下常规培养。

1.3 配制不同浓度的SchA 根据前期实验结果，溶剂 DMSO的工作液体积浓度选择为0.3%，SchA在DMEM培养基中的终浓度分别为1、3、5 μmol/L[7]。

1.4 MPP+浓度的选择 我们通过前期实验发现，不同浓度的MPP+处理SH-SY5Y细胞48 h，其药物的IC50值为0. 986 mmol /L，接近1 mmol /L，因此在后续试验过程中SH-SY5Y细胞培养基中MPP+的工作液浓度确定为1 mmol /L[7]。

1.5 AO/EB染色观察SH-SY5Y细胞形态学改变 各组细胞培养于24孔无菌培养板中，细胞分为对照组、MPP+组(1 mmol /L MPP+)、MPP+及不同浓度的SchA共同作用组(1 mmol/L MPP++1 μmol/LSchA，1 mmol/L MPP++3 μmol/LSchA，1mmol/L MPP++5 μmol/LSchA)，加入AO/EB染料后激光共聚焦显微镜下观察各组细胞核形态改变。

1.6 Tunel染色检测细胞凋亡水平 SH-SY5Y细胞常规接种于24孔板内，各组细胞给药48 h后，4%多聚甲醛固定，按Tunel试剂盒操作步骤进行处理，光学显微镜下观察及拍照。

1.7 Western-Blot检测ERK及p-ERK表达水平 常规收集细胞，BCA法测定各组蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳，低温电转至PVDF膜上。ERK、p-ERK一抗用封闭液稀释后加于PVDF膜上，4 ℃孵育过夜。之后加入HRP标记的二抗37 ℃反应1 h，在膜上滴加化学荧光液，曝光显影。

2 结果

2.1 AO/EB双染观察各组细胞形态学变化 各组SH-SY5Y细胞经AO/EB双染后结果显示，对照组绝大多数细胞细胞核呈圆形或椭圆形的绿色荧光，MPP+染毒组细胞核形状差异较大，橙红色细胞核斑块、碎片较多，而给予了 1～5 μmol/L schA后橙红色细胞核比例明显减少(见中插彩版图1)。

2.2 Tunel染色检测各组细胞凋亡水平 MPP+处理48 h后，与对照组相比，可见较多的浓染细胞核及细胞核碎片，而随着SchA浓度的增加，凋亡SH-SY5Y细胞数逐渐减少(见中插彩版图2)。

2.3 SchA对MPP+染毒的SH-SY5Y细胞ERK及p-ERK表达量的影响 实验结果显示，与对照组相比，MPP+染毒组SH-SY5Y细胞p-ERK相对表达量明显降低(P<0.05)，提示MPP+可抑制ERK信号转导通路的活化，而与MPP+染毒组相比，SchA干预能够有效促进ERK的磷酸化活化(P<0.05，图3)。

3 讨论

随着人类社会逐渐进入老龄化，帕金森病(Parkinson′s disease, PD)的发病率不断增多。PD患者一般于50岁以后发病，60岁以后进入发病高峰期。目前临床上尚未找到有效控制疾病发展的方法及手段，而寻找及研发有效治疗药物一直是PD防治的重点内容。在PD的发病过程中，多巴胺能神经细胞丢失是PD的重要发病机制和引起PD各种临床症状的重要原因[9]。我们的实验结果显示，与对照组相比，PD模型组细胞存在明显的细胞凋亡现象，提示凋亡可能是PD神经细胞损失的重要原因。

细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)发现于20世纪80年代，是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。大量的研究结果证实，作为丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号转导通路家族成员之一，ERK信号转导通路与体内多种生理活动有关。当ERK发生磷酸化活化后，能够促进细胞的生长、增殖及分化，并能够显著抑制细胞凋亡[10-11]，ERK1及ERK2是ERK 家族中最重要的成员，广泛表达于全身各种组织细胞中。有研究发现，ERK信号转导通路活化后，能促进小鼠海马长时程增强(1ong-term potentiation，LTP)的形成[12]。另有研究显示，ERK信号转导通路的活化与学习记忆过程密切相关[13]。

图3 SchA对MPP+作用的SH-SY5Y细胞ERK和p-ERK蛋白表达水平的影响注：*与对照组比较，P<0. 05；#与MPP+比较，P<0. 05

我们通过试验发现，在SchA干预后，SH-SY5Y细胞凋亡现象明显减轻，凋亡细胞数减少，提示SchA具有明显的抗凋亡作用。在此基础上，我们进一步对SchA的抗凋亡分子机制进行了初步的研究，检测了与细胞生长、增殖密切相关的ERK信号分子的磷酸化活性水平。实验结果显示，与对照组相比，MPP+染毒的SH-SY5Y细胞中ERK的活化受到明显抑制，而给予SchA能够促进ERK的磷酸化活化。且随着SchA浓度的增加，p-ERK的相对表达量逐渐增加，提示ERK信号转导通路在SchA抑制MPP+引起的SH-SY5Y细胞凋亡过程中起着重要的作用。

综上所述，SchA通过促进ERK信号转导通路的活化，从而抑制了帕金森病细胞模型的凋亡，保护了多巴胺能神经细胞，其抗凋亡的具体分子机制有待进一步深入研究。

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StudyontheEffectofSchAtoERKSignalPathwayinMPP+-treatedSH-SY5YCells

LI Yan1, ZHANG Wei1, CAI Tong-jian2, ZHAO Dong-hai1, LUO Jun1, LV Shi-jie1

(1.Basic Medical College,Jilin Medical Univercity,Jilin 132013,China; 2.Preventive Medical College,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

To explore the pharmacological actions and molecular mechanisms of SchA on the apoptosis of MPP+to human neuroblastoma SH-SY5Y cells. The changes of morphological characteristics in SH-SY5Y cells were analyzed by acridine orange(AO)/ethidium bromide(EB) staining and Tunel Kit. Subsequently,ERK and p-ERK levels were analyzed by western-blot assay. Compared with control group,a marked up-regulation of apoptosis was observed in SH-SY5Y cells after being treated with 1mmol/L for 48 h. SchA intervention in each concentration group could effectively inhibit the apoptosis of SH-SY5Y cells. It also showed that the expression of p-ERK protein in MPP+group was significantly inhibited when compared with the negative control group , while the p-ERK level in each SchA intervention group was significantly higher when compared with MPP+exposed group(P< 0.05) A dose-dependent effect was observed. The data indicate that MPP+has the effect on promoting apoptosis in SH-SY5Y cells,and SchA can obviously alleviate the apoptosis of SH-SY5Y induced by MPP+,which may be related to the changes of ERK signal transduction pathways.

MPP+; Schisandra A ; Parkinson’s disease ; apoptosis ; ERK

LV Shi-jie

R151.2

A

0529-6005(2017)08-0050-03

2017-03-07

国家自然科学基金资助项目(81372952)；吉林省教育厅科研项目(2015407)

李妍(1974-)，女，副教授，博士，从事神经系统退行性疾病发病机制及防护研究，E-mail：liyan511700@163.com

吕士杰，E-mail：Lvshjie-qr@163.com