棘球蚴基因工程亚单位疫苗免疫绵羊的效果研究

阚 威，蔡金山，赵全邦 ，沈艳丽，马占全，胡广卫 李 静，王小红，才 华

(1．青海省动物疫病预防控制中心 ， 青海 西宁 810000 ； 2．青海省贵南县动物疫病预防控制中心 ， 青海 贵南 813100 ；3．青海省泽库县动物疫病预防控制中心 ， 青海 泽库 811400)

棘球蚴基因工程亚单位疫苗免疫绵羊的效果研究

阚 威1，蔡金山1，赵全邦1，沈艳丽1，马占全1，胡广卫1李 静1，王小红2，才 华3

(1．青海省动物疫病预防控制中心 ， 青海 西宁 810000 ； 2．青海省贵南县动物疫病预防控制中心 ， 青海 贵南 813100 ；3．青海省泽库县动物疫病预防控制中心 ， 青海 泽库 811400)

采用羊棘球蚴基因工程亚单位疫苗对2 315只3～20月龄藏系绵羊进行3次免疫试验，并用间接ELISA对免疫后的抗体进行动态监测。检测结果显示,首免前、首免1周后、二免1周后、二免1年后、三免1周后、三免后6个月的血清抗体阳性率依次为0%、98.75%、94.94%、40.74 %、98.72%、50%。同时，对同龄、同群、同草场放牧的羊三免1年后进行剖检，免疫组59只、对照组60只。结果显示，对照组感染率、感染强度为86.67%和3.43，免疫组感染率、感染强度为45.76%和0.86，免疫保护率(减囊率)为69.38%。

棘球蚴病 ； 棘球蚴基因工程亚单位疫苗 ； 免疫研究

棘球蚴病(Echinoccosis)俗称包虫病(Hydatidosis),是一种人兽共患寄生虫病。据调查，在我国西北畜牧业发达地区的人群血清阳性率为1.06%～32%，患病率为1.0%～7.64%[1]，而我国动物感染棘球蚴病每年造成的畜产品经济损失高达8亿元以上[2]。青海省是我国棘球蚴病高发流行区，家畜和人的感染率位居全国前列。2006年，王虎等[3]调查显示，1995-2005年青海省人与动物棘球蚴病血清阳性率和患病率逐年升高，而动物棘球蚴的血清阳性率和患病率以果洛、玉树、黄南三州最高，海南、海北两州次之，海东、西宁及柴达木盆地的海西州较低。2000年，蔡金山[4]等对青海省牛、羊棘球蚴病流行情况就有调查研究，其调查结果显示，在青海省称多、甘德、泽库、德令哈、贵南5县(市)羊棘球蚴感染率为53.14%，平均感染强度为4.41，牛棘球蚴感染率60.36%，平均感染强度5.59。2010年对贵南、称多、德令哈3个县(市)羊棘球蚴平均感染率为39.02%，平均感染强度2.4，牛棘球蚴平均感染率为33.12%，平均感染强度1.3。总之，近十几年，青海省人群和动物都患有或感染不同程度的棘球蚴病，防治工作刻不容缓。本试验旨在研究羊棘球蚴病基因工程亚单位疫苗对藏系绵羊的免疫效果，为在藏系绵羊使用该疫苗提供依据。

1 材料与方法

1.1 免疫疫苗 羊棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗：由重庆澳龙生物制品有限公司生产。疫苗生产批号：20121001。

1.2 试验羊的筛选及免疫方法 结合近几年青海省棘球蚴病流行病学调查报告，综合分析选择贵南县森多乡和泽库县和日乡部分牧户饲养的6周龄左右的新生羔羊进行免疫颈部皮下注射，并双耳标标识。同时，在各试验羊群设等数量、同龄、同草场放牧的羊作为对照组。试验组羊共免疫3次，首免：6周龄第1次免疫；二免：首免4周后加强免疫1次；三免：首次免疫1年后再加强免疫1次。每次免疫后观察7 d，通过对羊只的体温、呼吸频率、运动状况、采食情况和注射部位的感官变化对疫苗的安全性进行评价。

1.3 抗体检测时间 分别在首次免疫前、首免后1周后、二免1周后、二免1年后、三免1周后、三免后6个月采集试验羊血样，检测血清抗体，共检测血清892份。

1.4 免疫抗体检测 应用重庆澳龙生物制品有限公司生产的羊棘球蚴(包虫)ELISA抗体检测试剂盒(生产批号：20141101)进行血清抗体检测。主要操作程序：抗原包被-封闭，37 ℃，温育60 min-洗板-加兔抗羊酶标抗体-封闭，37 ℃，温育60 min-洗板-加底物显色-终止反应-用酶标仪450 nm测定OD值。判定标准：样品450 nm>0.6，判为阳性。

1.5 免疫保护效果的检验 三免6个月后剖检免疫组和对照组羊共159只，其中泽库县对照组30只、免疫组29只，贵南县对照组30只、免疫组30只。按寄生虫检查法取其肝、肺、肾、脾和心脏进行剖检， 记录每只羊感染棘球蚴包囊的数量、包囊大小，分别计算棘球蚴的感染率、感染强度，免疫保护率(减囊率)=(1-免疫组平均包囊数/对照组平均包囊数)×100%。

2 结果

2.1 疫苗的安全性 本试验前后共进行3次免疫， 共免疫2～20月龄羊2 315只。在疫苗使用过程中，加入灭菌生理盐水后溶解度好，呈均匀混浊。每次注射疫苗后观察7 d，羊体温、呼吸频率、运动状况和采食情况均正常，免疫7 d后触摸注射部位无异常感觉，使用该疫苗免疫羊群后未出现不适反应，疫苗安全性高。

2.2 ELISA免疫抗体检测结果 对首次免疫前、首免1周后、二免1周后、二免1年后、三免1周后、三免后6个月采集的892份血清样品进行抗体检测，结果显示，2个县首免前血清抗体平均阳性率为14.04%，首免后1周抗体平均阳性率98.75%，二免后1周阳性率为94.94%，二免1年后阳性率40.74%，三免1周后阳性率98.72%，三免6个月后阳性率为50%(表1、图1)。

表1 ELISA免疫抗体检测结果

图1 ELISA免疫抗体检测结果

2.3 血清OD值测定结果 通过ELISA法检测定期采集的血清，按相应的免疫阶段和血清抗体OD吸收值进行汇总统计，免疫组羊首免前、首免1周后、二免1周后、二免1年后、三免1周后、三免6月后血清抗体OD吸收值有明显的变化，其OD值与免疫羊特异性抗体呈正相关水平。从每个阶段免疫羊特异性抗体的动态变化可以看出，用棘球蚴基因工程亚单位疫苗二免1周后和三免1周后血清抗体水平显著升高，二免1年后、三免6个月后血清抗体OD吸收值为0.592和0.403，说明免疫羊群经两次免疫一年后抗体水平开始下降(表2、图2)，但是抗体水平依然维持在较高水平。

2.4 感染率和感染强度变化 在贵南和泽库县对三免后6个月的羊和对照组的羊进行剖检，共剖检了119只羊，免疫羊59只、对照羊60只。结果，泽库县30只对照羊中有26只羊感染有不同发育程度的包虫囊，感染率为86.67%，感染强度为3.36；29只免疫羊中有12只羊感染有发育程度较低的包虫囊，感染率为41.38%，感染强度为0.52。贵南县30只对照羊中有26只感染有不同发育程度的包虫囊，感染率为86.67%，感染强度为3.50，30只免疫羊中有15只羊感染有发育程度较低的包虫囊，感染率为50.00%，感染强度为1.2。两县合计，对照组平均感染率为86.67%、感染强度为3.43，荷囊数为0～19 个不等，荷囊数最多的达19个，包囊直径最大达20 mm；免疫组平均感染率为45.76%、感染强度为0.86，荷囊数为0～12个不等，最多的12个，包囊直径最大的12 mm(表2)，免疫保护率(减囊率)为69.38%。

表2 免疫组羊血清抗体OD平均吸收值

图2 免疫组羊血清抗体OD吸收值变化

表3 剖检统计结果

3 讨论与小结

在较长一段时间内，经国内外学者研究证实，细粒棘球蚴绦虫六钩蚴阶段具有良好的免疫保护效果，就针对六钩蚴阶段分泌物(ES)抗原，Osborn等(1982)[5]、朱兴全等(1991)[6]、哈江等(1994)[7]对羔羊进行免疫研究，研究结果显示，该分泌物抗原对羔羊免疫后均可获得十分理想的免疫保护效果，其免疫保护率分别为99.4%、96.04%和97.3%，Heath等[8](1996)对细粒棘球绦虫六钩蚴阶段的分泌物抗原分析发现，其中23～25 kD 的蛋白(Eg95)成分为特异性保护抗原，并通过免疫试验证实，羔羊可获得93%的保护效果。因此，利用基因工程技术研制的以Eg95 重组蛋白为主要成份的疫苗，是目前世界上惟一用于预防羊棘球蚴的疫苗， 该疫苗在新西兰、澳大利亚、阿根廷等国的绵羊免疫试验表明，对不同棘球绦虫虫株的感染具有很好的免疫保护作用。

本次试验所用疫苗由重庆澳龙生物制品有限公司生产，其主要成分是Eg95 重组蛋白，对藏羊免疫一年后血清抗体阳性率达到94.94%，一年内免疫保护率为100%，第二年的免疫保护率达到69.38%，与前述报道结果一致，对藏羊棘球绦虫的感染具有较好的免疫保护作用，达到了通过对羊进行免疫降低棘球蚴感染率和感染强度下降的目的。虽然第二年测得的直接减囊保护率为69.38%，按照实际荷囊数、包囊大小和育囊不育囊所占的比例分析，实际保护率远高于69.38%。为便于推广棘球蚴(包虫)病基因工程亚单位疫苗应用，建议采取3次免疫的免疫程序，对新生羊羔6周龄首免，间隔期1个月二免，第2年三免。

[1] Current on Chinese significance parasitosis by Department of Health to issue[C].MOH web， 2005:5：17.

[2] Extended review onechinocciasisprevalence in our country[J].Chines Journal of Epidemiology，2006，2:14-127.

[3] 王虎,张静宵,Schantz P M,等. 1995-2005年青海省棘球蚴病流行病学调查分析[J] .中国人兽共患病学报,2006,22(12):1 129-1 134.

[4] 蔡金山,马睿麟,李连芳,等. 青海省牛、羊棘球蚴病流行病学调查[J].中国动物检疫,2013,30(1):46-47.

[5] Osborn P J ,Heath D D.Immunisation of lambs against Echinococcus granulosus using antigens obtained by incubation of oncospheres in vitro[J]. Res Vet Sci,1982, 33 :132-133.

[6] 朱兴全,窦兰清,史晓红,等.细粒棘球绦虫排泄分泌抗原研究-六钩蚴排泄分泌抗原的原性[J].中国兽医科技,1991,21(9):6-9.

[7] 哈江,吐尔洪,张壮志,等.棘球蚴(包虫)病的预防研究[J].草食家畜,1994,(增刊):28-31.

[8] Heath D D,Lawrence S B .Antigenic polypeptides of Echinococcus granulosus oncosphercs and definition of protective molecules[J].Parasite Immunology,1996, 18:347-357.

TheprophylacticeffectoftheSheepRecombinantHydatidsSubunitvaccineonhydatiddisease

KAN Wei1, CAI Jin-shan1, ZHAO Quan-bang1, SHEN Yan-li1, MA Zhan-quan1, HU Guang-wei1, LI Jing1, WANG Xiao-hong2, CAI Hua3

(1.Animal Disease Prevention and Control Center of Qinghai Province, Xining 810003, China ;2.Animal Disease Prevention and Control Center of GuiNan Country, Guinan 813100，China ;3. Animal Disease Prevention and Control Center of ZeKu Country, Zeku 811400，China)

This study aims to establish three immune experiments for 2315 Tibetan sheep about 3 ～ 20 months in Zeku and Guinan county of Qinghai province by using the Sheep Recombinant Hydatids Subunit vaccine, and the antibody was analyzed by Indirect ELISA dynamic monitoring. The results showed that the positive rate of primary immunization、primary immunization after a week、booster immunization after a week，booster immunization after a year,he third immune after a week and the third immune after six months serum antibody was 0,98.75%,94.94%,40.74 %,98.72% and 50%. At the same time , 59 sheep were selected from the same age, the same group, and the same free grazing pastures sheep for autopsy 1 years later the third immune, and the control number was 60. The results showed that infection rate and infection intensity of the control group were 86.67% and 3.43, infection rate and infection intensity of the immunized group was 45.76% and 0.86, and immune protection ratio was 69.38%.

Hydatid disease ; Recombinant Hydatids Subunit vaccine ; Immune research

CAI Jin-shan

S852.73+2

A

0529-6005(2017)08-0010-03

2016-11-21

中国动物疫病预防控制中心“棘球蚴病综合防控技术集成与示范项目”

阚威(1986-)，男，兽医师，硕士，从事动物防疫工作，E-mail：Kanweid@163.com

蔡金山，E-mail：cjshlyf@163.com