姜黄素对糖尿病大鼠视网膜中Ets-1表达的影响

何琼，何建中，赖伟，邱艳飞

(萍乡市人民医院眼科，江西 萍乡 337000)

姜黄素对糖尿病大鼠视网膜中Ets-1表达的影响

何琼，何建中，赖伟，邱艳飞

(萍乡市人民医院眼科，江西 萍乡 337000)

目的 观察姜黄素对糖尿病大鼠视网膜E26转录因子-1（Ets-1）表达的影响，探讨姜黄素治疗抑制糖尿病视网膜病变的可能机制。方法 采用腹腔注射链尿佐菌素（STZ）60mg/kg诱导大鼠糖尿病模型，将20只造模成功的动物随机分成糖尿病组（10只），姜黄素治疗组（10只），取等量正常大鼠作为空白对照组。治疗组在大鼠出现糖尿病表现后按姜黄素200mg/(kg·d)灌胃，姜黄素用质量分数1%羧甲基纤维素配成混悬液后给药，共8周。糖尿病组及治疗组同期给予等量的1%羧甲基纤维素灌胃，连用8周。8周后取大鼠眼球分别行免疫组化、用ELISA法测定Ets-1浓度。结果 ELISA法测得糖尿病组的Ets-1浓度比正常组增加（P＜0.05），治疗组Ets-1浓度比糖尿病组低（P＜0.05），但比正常对照组高（P＜0.05）。免疫组化显示正常对照组视网膜中Ets-1阳性细胞微量表达，糖尿病组及姜黄素治疗组大鼠视网膜组织中Ets-1阳性细胞大量表达，且姜黄素治疗组大鼠视网膜组织中Ets-1阳性细胞表达程度低于糖尿病组。电镜结果提示糖尿病组及姜黄素治疗组均可看到糖尿病视网膜病变的病理改变，但姜黄素治疗组的病理改变程度比糖尿病组要轻。结论 姜黄素可抑制糖尿病大鼠视网膜ETS-1的表达，从而缓解其糖尿病视网膜病变进程。

糖尿病视网膜病变；Ets-1；姜黄素

糖尿病视网膜病变 （diabetic retinopathy，DR）的致盲率极高，其发生机制可能是血-视网膜屏障((breakdown of blood-retinal barrier，BRB))损伤导致血管通透性增加，最终生成眼内新生血管[1，2]，导致视力丧失。Ets家族作为作为转录因子，包括30多个家族成员，而Ets-1是其家族中研究较多的成员之一。Ets可以通过诱导降解基质酶的表达发挥降解基质的作用，促使基底膜分解，为血管生成作好准备[3]。国内外众多研究都表明Ets-1能促进血管生成，是血管形成过程中重要的调节因子。姜黄素是从姜科姜黄属的草本植物中提取出来的活性成分，作为我国的传统中草药，其具有多种疗效，研究表明姜黄素有抗氧化抗炎作用[4，5]、抗肿瘤作用[6，7]、抗微生物作用[8]、抑制血管生成[9]、保护肝肾[10]等多种作用。我们将其对大鼠糖尿病模型进行早期干预，观察其对视网膜组织中Ets-1表达的影响，为临床糖尿病视网膜病变的治疗开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 材料链尿佐菌素（STZ）（Sigma公司）；血糖仪和标准试纸 （强生公司），纯度99%姜黄素；Ets-1检测试剂盒购自上海西塘科技生物有限公司。TACHICF 16RX低温离心机，恒温水浴仪，酶标仪。南昌大学医学院动物部提供健康Sprague-Dawlay大鼠 40只，雌雄不限，体重 180～220g，经眼部检查无明显异常。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组健康成年雄性SD大鼠40只，体重180～220g，眼部经裂隙灯和检眼镜检查屈光间质清晰，眼底无病变.饲养于南大医学院实验动物中心，饲养环境符合医学实验动物环境设施要求。大鼠随机取对照组（10只）、剩余30只大鼠注射STZ诱导成糖尿病，取20造模成功的大鼠随机分为糖尿病组（10只）、姜黄素治疗组（10只）。

1.2.2 造模与取材造模：糖尿病和姜黄素治疗组大鼠空腹12h，0.1%枸橼酸盐缓冲液配制成浓度为1%的STZ溶液，30只造模大鼠按60mg/kg剂量左下腹内注射，72h后尾静脉取血测血糖，血糖≥l6.7 mmol/L者确定为糖尿病实验对象。正常对照组腹腔注射等量枸橼酸盐缓冲液。成模当天作为实验开始时间，治疗组将姜黄素200mg/(kg·d)灌胃，共8周。同期将正常对照组和糖尿病组大鼠给予等量的1%羧甲基纤维素灌胃，连续8周。

取材：各组大鼠分别在喂养8周后，以颈椎脱臼法猝死大鼠，立即取大鼠右侧眼球行ELISA测定，左侧眼球置福尔马林固定用以免疫组化及电镜切片。

1.2.3 各组视网膜组织均经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，经DAB显色后苏木精复染，封片。光学显微镜下观察各组大鼠视网膜Ets-1阳性细胞表达情况。

1.2.4 ELISA实验方法及结果分析取视网膜组织匀浆离心，取上清液。每孔中各加入标准品或上清液样品 100μl，置 37℃ 120min，洗板，每孔中加入一抗 100μl，置 37℃ 60min，洗板，每孔加入酶标抗体 100μl，置 37℃ 30min，洗板，加入底物工作液100μl，置 37℃ 15min，加入终止液 100μl，30min 内用酶标仪在450nm处测吸光值。根据样品吸光值在曲线图上查出相应Ets-1浓度。

1.2.5 电镜检查各实验组大鼠处死后迅速摘除眼球，2.5%戊二醛固定2h，切取小块视网膜组织，经梯度乙醇脱水、渗透、包埋等处理，超薄切片，再以质量分数2%醋酸铀和枸椽酸铅双重电子染色后，在透射电镜下观察拍照。

2 结果

2.1 Ets-1浓度测定正常大鼠视网膜就有Ets-1的表达，糖尿病组比正常对照组表达浓度显著增加，姜黄素治疗组较糖尿病组表达浓度降低，但比正常对照组高。组间两两比较差异均有统计学意义（见表 1）。

表1 大鼠视网膜Ets-1表达（x±s）

2.2 免疫组化情况正常对照组大鼠视网膜中Ets-1阳性细胞少量表达于视网膜组织中的内核层、神经节细胞层以及色素上皮层。糖尿病组大鼠视网膜中Ets-1阳性细胞大量表达于视网膜组织中，其表达位置层次与正常对照组相同。姜黄素治疗组中Ets-1阳性细胞大量表达于大鼠视网膜组织，其表达位置层次与正常对照组相同，但阳性反应程度较糖尿病组轻（见图1A-1C）。

2.3 电镜超微结构观察结果正常对照组大鼠视网膜膜盘结构清晰，排列整齐，光感受器细胞排列整齐形态规则，核染色质均匀。糖尿病大鼠视网膜膜盘结构分离，排列紊乱。光感受器细胞肿胀，核形态不规则，吞饮小泡增多，粗面内质网及线粒体肿胀，呈空泡状，姜黄素治疗组视网膜细胞超微改变较糖尿病组改变程度减轻，但与正常对照组比较仍有病理改变（见图2A-2C）。

图1 免疫组化结果

图2 电镜视察结果

3 讨论

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetesmellitus，DM)引起的全身各组织器官微血管病变中最严重的并发症，其发生机制目前尚未完全阐明，新生血管的形成是DR的主要致盲原因。血管的形成中主要包含5个阶段：⑴血管基底膜的降解；⑵血管内皮细胞的迁移；⑶血管内皮细胞的增殖、粘附并连接；⑷管腔样结构的形成；⑸基质重塑、平滑肌细胞包绕以及血管的相互吻合，最终形成血管网[11]。越来越多的研究成果证实Ets家族在血管生成过程中起着尤为重要的作用。Ets基因最早是在美国马里兰的Frederick国家癌症研究所分子肿瘤学实验室发现的[12]，在研究禽类反转录病毒E26时发现了v-ets[13]，E26是禽类白血病病毒，是一个复制缺陷的逆转录病毒，因而根据z26(E-Twenty-Six)英文缩写而将此基因命名为Ets。Ets-1是Ets转录因子家族中的第一个亚族，同时也是研究得最多的一个亚族，Ets-1位于染色体的位置为11q23-24，分子质量54KD，含有450个氨基酸，包含多个功能区。Hashiya等使用HVJ-转染方法证实了体内Ets-1的促血管生成作用，这种作用是通过Ets-1作为转录因子过表达上调血管生成因子如血管内皮生长因子 （VEGF）和肝细胞生长因子（HGF）实现的[14]。Ets-1诱导基质金属蛋白酶（MMP1，MMP3，MMP9）的表达，从而促进血管内皮细胞迁移游走。血管内皮生长因子（VEGF）的特异性受体Flt-1和Flk-2的启动子区含有Ets结合位点。Ets-1的表达增加了内皮细胞的粘附并且刺激它们变成类毛细血管结构[15]。

姜黄素是从姜黄的根茎中提取的一种橙黄色的略带酸性的酚类物质，是姜黄发挥药理作用的主要成分。姜黄素不溶于水对热稳定，但在光照以及碱性溶液中不稳定。国内对姜黄素在肿瘤方面研究较多，但在眼科的应用尚少，随着对姜黄素药理作用研究的深入，其应用也随之广泛，正越来越多的应用于眼科领域，目前已成为国内外研究热点。Mrudula T等研究发现姜黄素可以抑制糖尿病大鼠视网膜新生血管生长[16]，近年来已有关于姜黄素抑制糖尿病大鼠视网膜中巨噬细胞游走抑制因子[17]及低氧诱导因子表达[18]的报导，但姜黄素在眼科的临床应用尚需更多的实验依据，本实验通过对糖尿病大鼠视网膜Ets-1表达的研究进一步探讨姜黄素对糖尿病视网膜病变进程的延缓机制，为姜黄素应用于临床进一步提供佐证。

本实验表明，姜黄素可以下调Ets-1的表达，在组织病理学上减轻糖尿病视网膜病变的病变程度，从而证实姜黄素对糖尿病视网膜病变的治疗效果。但因本实验样本量尚小，还需大量的临床随机对照研究，使得实验结果更加可靠。

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The effect of Curcum in on the expression of E26 transformation Specific-1(Ets-1)in Diabetic Rats

HE Qiong，HE Jianzhong，LAIWei，QIU Yanfei.
Department of Ophthalmology，The People’S Hospital of Pingxiang City in Jiangxi Province，Pingxiang Jiangxi337000，China.

Objective To observe the effects of Curcumin on the expression of E26 transformation specific-1(Ets-1)in the retina of diabetic rats.Methods 20 SD rats of successful diabeticmodelswere randomly divided into diabetes group and Curcumin treatment group，which were induced into diabetes by streptozotocin(60mg·kg-1)intraperitoneal injection each group 10 rats.Another 10 normal rats were recruited as normal control group.Cureumin 200mg/(kg·d)containing carhoxymethylcellulose was administered intragastrically last for 8 weeks after themodels formed in Curcumin treatment group.And only oarboxymethylcellulose was given at the same way in diabetes group and normal control group for 8 weeks.After 8 weeks，the eyes of 10 rats in each group were removed，and used to detected the expression of Ets-1 in the retinas by ELISA and immunohisochemistry.Results The results of ELISA showed that the expression level of Ets-1 in retina in diabetes group was significantly higher than normal control group(P＜0.05).The Curcumin treatment group was lower than diabetes group(P＜0.05)，buthigher than control group(P＜0.05).The results of immunohisochemistry showed that the expression of Ets-1 positive cells in retina was trace expressed in control group，but strongly expressed in diabetes group and Curcumin treatment group，and especially the diabetes group.The pathological changes of diabetic retinopath were observed by electron microscopy in diabetes group and Curcumin treatment group.The degree of pathological changes in Curcumin treatment group was lower than those in diabetes group.Conclusion Curcumin could inhibits the expression of Ets-1 in retina of diabetic rats and alleviates the progression of diabetic retinopathy.

Diabetic retinopathy；Ets-1；Curcumin

R587.1，R-332

A

1674-1129(2017)05-0677-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.013

何琼，女，1982年生，硕士研究生，主治医师，眼科学，研究方向：主要从事眼底病诊治方面工作。Email：heqiong1221@sina.com。

2017-01-13；

2017-08-05)