2016年福建省永安及南平监测点五种致泻性大肠埃希菌监测分析

郑恩惠 ，林杰 ，李曲文 ，杨劲松 ，陈爱平 ，2

(1、福建省疾病预防控制中心，福建 福州 350001；2、福建省人兽共患病研究重点实验室，福建 福州 350001)

2016年福建省永安及南平监测点五种致泻性大肠埃希菌监测分析

郑恩惠1，林杰1，李曲文1，杨劲松1，陈爱平1，2

(1、福建省疾病预防控制中心，福建 福州 350001；2、福建省人兽共患病研究重点实验室，福建 福州 350001)

目的 对福建永安及南平两个检测哨点2016年的281份腹泻病例进行5种致泻性大肠埃希菌病原检测，为病例的确诊及致泻性大肠埃希菌流行病学的提供实验数据。方法收集281份其他感染性腹泻病例(排除霍乱、菌痢、伤寒副伤寒)的粪便标本，接种麦康凯平板，选取初步生化符合大肠杆菌的菌落，然后用致泻性大肠埃希菌多重PCR和单重PCR检测方法确定其致病型别。结果 281份腹泻病例粪便标本共检出致泻性大肠埃希菌17株，检出率6.05%，其中aEPEC 4株，ETEC 6株，EAEC 7株，其他型别未检出。结论 福建地区致泻性大肠埃希菌致病型别以aEPEC，ETEC，EAEC为主，多重PCR检测方法能有效的对致泻性大肠埃希菌病进行确诊及了解菌株的毒力基因携带情况，并为我省的致泻性大肠埃希菌的流行病学资料的积累及疾病防控提供快速客观的依据。

感染性腹泻；致泻性大肠埃希菌；毒力基因

感染性腹泻是临床常见的一种症状，常见的病因有细菌、病毒、寄生虫等不同病原体引起[1]，在细菌感染性腹泻中，致泻性大肠埃希菌也是其中的一种。大肠埃希菌(Escherichia coli，E coli)是人肠道中正常菌群，只有少数具有致病性，其致泻性主要取决是否携带有相应的毒力基因，根据毒力、致病性及流行病学等可将致泻性大肠埃希菌（Diarrheagenic Escherichia coli，DEC）可分为 5 类，即肠产毒性大肠埃希菌（ETEC）、肠致病性大肠埃希菌（EPEC）、肠出血性大肠埃希菌（EHEC）、肠侵袭性大肠埃希菌 （EIEC）及肠聚集性大肠埃希菌（EAEC）[2]。由于致泻性大肠埃希菌可通过食物、水源等方式传播，有可能导致疫情暴发，为此开展腹泻病例中5种致泻性大肠埃希菌的监测工作，对于了解其流行病学特征、临床研究及疾病防控具有一定的研究意义。

1 材料与方法

1.1 菌株来源根据2016年福建省其他感染性腹泻(排除霍乱、菌痢、伤寒副伤寒)监测方案采集了281份腹泻病例粪便，其中福建省南平市延平区疾病预防控制中心156份和福建省永安市疾病预防控制中心125份，初步鉴定均为大肠埃希菌的菌株。

1.2 试剂和仪器五种致泻大肠埃希菌多重PCR检测试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs购自大连宝生物工程有限公司，琼脂糖为BioAsia进口分装品，DL2000 DNA Marker（批号：B7501A）购自宝生物工程 （大连）有限公司；PCR扩增仪为G-Storm（英国 Gene Technologies公司），Basic电泳仪，凝胶成像分析系统为Molecular Imager Gel Doc XR System（美国Bio-Rad公司）。

1.3 实验方法将分离的菌株接种在普通营养琼脂上37℃，培养18～24h，每个平板挑起3个单克隆菌落加100μl灭菌双蒸水中混匀，煮沸10min，10000r/min离心5min，取上清做为PCR检测的DNA模板，多重及单重PCR的反应体系及扩增程序严格按试剂盒操作说明书进行。

2 结果

2.1 菌株的多重PCR图谱结果 见图1。

2.2 检出的致泻性大肠埃希菌情况 281份粪便标本的检出17株致泻性大肠埃希菌，阳性率为6.05%，其中aEPEC 4株，ETEC 6株，EAEC 7株。（见表 1）。

3 讨论

致泻性大肠埃希菌(DEC)是一类能引起腹泻的重要病原菌，近年来由致泻大肠埃希菌(DEC)引发的食物安全成为人们关心一个重要公共卫生问题。因此对DEC的快速诊断显得尤为重要，但由于DEC与普通大肠埃希菌在表型上无明显差异，用传统的培养和生化分型方法无法有效进行区分鉴别是否为DEC。随着现代分子生物学技术的发展，利用多重PCR对致泻性大肠埃希菌种属鉴定（uidA 基因）和毒力基因（escV、bfpB、stx1、stx2、estⅠa、estⅠb、elt、invE、astA、aggR、pic）进行检测，能有效提高DEC的确诊。本文对281份粪便标本分离的大肠埃希菌进行致泻性大肠埃希菌检测，共检出17株DEC，阳性率为6.05%，其中aEPEC 4株，ETEC 6株，EAEC 7株，EHEC和EIEC未检出。国内外文献报道DEC阳性分离率为4.06%-12.0%不等[3-6]。优势菌群也不完全一样，如北京和山西以EPEC为主，而浙江地区主要为EAEC，墨西哥和巴西以EAEC为主，秘鲁以EHEC为主，不同国家不同地区优势菌型不尽相同，可能与环境卫生条件、经济状况以及饮食结构不同有关[7-9]。

图1 多重PCR图谱结果

表1 检出的致泻性大肠埃希菌情况

致泻性大肠埃希菌(DEC)多重PCR主要根据毒力基因进行鉴别，其设计引物的同时加入了uidA基因，是大肠埃希菌的属共同基因，然后再根据EPEC （escV和bfpB同时阳性为典型EPEC，escV阳性但bfpB阴性为不典型EPEC，但stx1、stx2均为阴性结果）、EHEC(escV、stx1、stx2 中有一条或者一条以上阳性）、ETEC(estⅠa、estⅠb、elt中有一条或者一条以上阳性)、EIEC(invE)、EAEC(astA、aggR、pic中有一条或者一条以上阳性)，若毒力基因阳性，判断为致泻性大肠埃希菌(DEC)。本文中分离到4株 aEPEC 即非典型 EPEC （escV+、bfpB-、stx1-、stx2-），而典型 EPEC（escV+、bfpB+、stx1-、stx2-）没有分离到，非典型EPEC也是近年来我省分离到比较多的 DEC 型别[4，9，13]，4 株 aEPEC 中有 3 株来自于小于1岁的婴幼儿。6株ETEC均为毒力基因elt阳性，以成年人为主要感染者。而7株EAEC中各有3株分别为毒力基因aggR和pic单独阳性，有1株为aggR和pic混合阳性，毒力基因的阳性分布差异是否与临床症状相关，值得在今后进一步加大样本量深入研究[10-12]。

本次监测结果显示17例致泻性大肠埃希菌(DEC)感染中，年龄分布中最小为4个月，最大为80岁，其中有8例为小于3岁的婴幼儿腹泻感染者，有3例大于60岁感染者，表明婴幼儿及老年人是DEC易感人群，应该加强健康教育及成为重要监测对象。17例病例均为6-9月份发现，表明夏秋季节是加强致泻性大肠埃希菌监控的时期[14-16]。

利用多重PCR能有效的监测其他感染性腹泻病例中致泻性大肠埃希菌感染情况，能快速检测其菌型分布及毒力基因携带情况，为掌握流行菌型变迁，为防控致泻性大肠埃希菌疫情提供快速客观的依据。

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R446.5，R378.2+1

A

1674-1129(2017)05-0671-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.011

福建省卫生厅医学创新课题（2011-CXB-19)

郑恩惠，1987年生，检验技师，本科，从事病原微生物检验，邮箱：450279983@qq.com

陈爱平，副主任医师，Email：cap2006@live.cn

2017-03-02；

2017-08-04)