烟熏大鼠心肌组织中缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子的表达

刘洋 闫蕊 李祥廷

烟熏大鼠心肌组织中缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子的表达

刘洋1闫蕊2李祥廷1

目的 研究缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）在烟熏大鼠心肌组织中的表达，探讨吸烟对大鼠心肌损伤的影响及可能机制。方法 SD大鼠随机分入对照组和实验组，实验组给予烟熏干预，8周后观察心肌形态学改变，并通过免疫组化染色及蛋白质印迹法观察HIF-1α、VEGF在两组大鼠心肌组织中的表达情况。结果 与对照组比较，实验组大鼠心肌细胞排列紊乱，且较为稀疏，部分肌原纤维扭曲甚至断裂。免疫组化染色及蛋白质印迹法结果显示，与对照组比较，实验组HIF-1α表达显著增加，而实验组VEGF表达显著下调（P＜0．05）。结论 吸烟可通过诱导大鼠心肌组织中HIF-1α表达上调、抑制VEGF表达进而介导心肌损伤。

烟熏；心肌组织；缺氧诱导因子-1α；血管内皮生长因子

吸烟会对心血管系统产生不利影响，是冠心病发生和进展的一个重要独立危险因素[1]。作为主要的可预防性环境有害因素，吸烟对心血管系统的影响及其发病机制也越来越受到人们的关注。

缺氧诱导子因子-1（HIF-1）是一种随着细胞内氧浓度变化而调节基因表达的转录激活因子，为异二聚体，由氧调节亚单位HIF-1α和结构亚单位HIF-1β组成。在正常氧浓度下，HIF-1α的氧依赖降解结构域上的特异性脯氨酰基被氧依赖性脯氨酰羟化酶羟基化，继而与肿瘤抑制蛋白结合，通过泛素-蛋白酶途径使HIF-1α迅速降解[2]。而在低氧条件下，HIF-1α稳定性增加，与HIF-1β亚单位结合形成二聚体HIF-1，进而激活转录过程[3]。HIF-1α既是HIF-1的调节亚基又是活性亚基，HIF-1的生理活性主要取决于HIF-1α的活性和表达。血管内皮生长因子（VEGF）是特异性的血管生成正性调节因子，具有促进内皮细胞分裂与增值、诱导新生血管生成、增加微血管通透性等重要生物学功能[4]。VEGF基因是受HIF-1α调控的重要靶基因之一，多项研究表明缺血性心脏病患者体内HIF-1α、VEGF的表达增加，然而目前尚未见到有关吸烟对心肌组织HIF-1α、VEGF表达的影响的报道。本研究通过烟熏干预建立动物模型，旨在通过研究烟熏大鼠心肌组织形态学改变及其HIF-1α、VEGF的表达情况，探讨吸烟对心肌损伤的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

SD雄性大鼠18只，体质量（150±15）g，均购于西安交通大学实验动物中心。所有动物在室温下饲养，均自由进食、进水，接受自然光照。七匹狼烤烟型香烟，福建中烟工业有限责任公司；山羊抗鼠血清，博士德生物工程有限公司；一抗为抗HIF-1α抗体、抗VEGF抗体，Abcam公司；二抗试剂盒，中杉金桥生物技术有限公司；DAB显色剂，博士德生物工程有限公司；BCA试剂盒，碧云天生物技术有限公司；内参β-actin单克隆抗体，三鹰生物技术有限公司；HRP-标记的羊抗兔IgG多克隆抗体，西安壮志生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组处理 将18只SD大鼠随机分为对照组和实验组，将实验组（n=9）大鼠置于30 cm×40 cm×60 cm的透明密闭容器内予以香烟烟熏，5支/次，30 min/次，2次/日，两次之间间隔6小时，共8周；对照组（n=9）大鼠自由进食，共8周。

1.2.2 心肌形态学观察 处死大鼠后取其心肌组织，进行以下操作：石蜡包埋，切片机切片，烤片，脱蜡至水，放苏木素液内5分钟，水洗，2%盐酸酒精分化10秒，水洗，放入1/500的氨水中至切片变蓝，水洗，放1%伊红内染5分钟，水洗，脱水透明，树胶封片，镜下观察并图像保存。

1.2.3 免疫组化 检测大鼠心肌组织中HIF-1α、VEGF的表达，具体操作步骤如下（以HIF-1α为例）：石蜡切片脱蜡至水，应用pH值为6.0、浓度为0.01 M的柠檬酸缓冲液微波进行抗原修复，3% H2O2去离子水孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性，PBS洗涤，加入山羊抗鼠血清封闭，室温孵育15 min，加入1：250稀释的一抗，4℃孵育过夜，PBS洗涤后滴加二抗，37℃孵育20 min，PBS洗涤后加入辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育30 min，PBS冲洗。DAB显色工作液避光孵育10 min，PBS冲洗后苏木素复染1 min，自来水冲洗。脱水、透明，封片后显微镜下观察。

1.2.4 蛋白质印迹法（Western Blot） 使用RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，计算50 μg蛋白量进行SDS-PAGE电泳，继而转印到PVDF膜，脱脂奶粉封闭后分别用HIF-1α 抗体（1∶ 2 000）、VEGF抗体（1∶3 000）及β-actin抗体（1∶900）4 ℃孵育过夜，PBST 洗涤后以相应Ⅱ抗室温孵育2 h，ECL法显影并用CCD相机拍照，采用UVP Software软件分析。以β-actin 作为内部参照。

1.2.5 统计学分析 采用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，各实验数据均以（x-±s）表示，组间差异采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠心肌组织形态学比较

由图1-A和图1-B对比可见，对照组心肌细胞排列有序、致密，而实验组心肌细胞排列紊乱，且较为稀疏，部分肌原纤维扭曲甚至断裂。

2.2 两组大鼠心肌组织中HIF-1α、VEGF表达水平的比较

图2、图3分别表示通过免疫组化染色观察HIF-1α、VEGF在两组大鼠心肌组织中的表达情况，图中棕黄色颗粒为所标记目的蛋白。如图所示，实验组HIF-1α表达水平高于其在对照组中的表达水平；而实验组VEGF的表达水平却低于其在对照组中的表达水平。

图4表示通过Western Blot测定的HIF-1α、VEGF在大鼠心肌组织中的表达情况。其结果与通过免疫组化法测定相一致，即：与对照组相比，实验组HIF-1α表达水平升高[（1.00±0.20）vs.（5.67±0.86）]（t=-8.882，P＜0.05），而VEGF的表达水平降低 [（1.00±0.09）vs. （0.31±0.12）]（t=8.727，P＜ 0.05）。

图1-A 对照组心肌组织HE染色结果

图1-B 实验组心肌组织HE染色结果

图2-A 对照组心肌组织HIF-1α免疫组化染色结果

图2-B 实验组心肌组织HIF-1α免疫组化染色结果

图3-A 对照组心肌组织VEGF免疫组化染色结果

图3-B 实验组心肌组织VEGF免疫组化染色结果

3 讨论

本研究得出以下结论：吸烟促使大鼠心肌损伤，表现为心肌细胞排列紊乱、肌原纤维扭曲断裂；同时，吸烟可以上调大鼠心肌组织中HIF-1α表达并下调VEGF表达，提示吸烟有可能通过此途径损伤心肌。

吸烟对心血管系统危害甚大，有文献报道，长期大量吸烟者副交感神经张力明显降低[5]，减弱其对交感神经兴奋的拮抗作用，同时香烟中的尼古丁成分亦可兴奋交感神经。因此，吸烟可以引起交感神经兴奋性增高，导致吸烟者心率增快、心肌收缩力增强、动脉收缩，从而使得心肌耗氧量增加、心肌供氧量不足，心肌处于缺氧状态。此外，吸烟后人体血液中COHb增加，COHb增多使Hb运输氧的能力减低，进一步加重了心肌缺氧[6]。缺氧环境使HIF-1α激活[7]，进而表现为HIF-1α表达增加。HIF-1的表达与活性除了主要受细胞氧浓度调节外，还受到其他一些重要的信号转导途径的调节，如PI3K及ERK/MAPL途径等[8]。吸烟是否影响了除细胞氧浓度外的其它途径，仍需进一步研究。

HIF-1表达增加是缺氧早期首发的分子水平的适应性反应，通过作用于靶基因，参与血管再生、红细胞生成、凋亡、细胞分化、糖代谢、pH值调节等。VEGF基因是受HIF-1α调控的重要靶基因之一，在VEGF 5’端增强子内存在HIF-1α结合位点，缺氧能够激活HIF-1αDNA结合活性，HIF-1α与VEGF 5’端增强子结合后使VEGF的转录和表达增强[9]。VEGF是内皮细胞特异性的促有丝分裂原，是最重要的促血管形成的诱导因子之一[10]。已有临床研究提示，心肌缺血缺氧越重，血清HIF-1α与VEGF的表达水平越高，且考虑VEGF表达增加受HIF-1α表达增加的激活与调控[11]。而在本研究中，烟熏大鼠心肌中VEGF的表达水平并未随HIF-1α的表达增加而增加，反而明显降低。国内外研究表明，吸烟抑制冠脉侧支循环的形成。由于VEGF的作用是促进新生血管形成，因此，我们认为吸烟可能通过抑制VEGF的表达而影响了冠脉侧支循环的形成。在这种情况下，缺血缺氧心肌无法有效形成新生血管，不能对缺血缺氧产生代偿性适应，进一步加重心肌损伤。

综上，吸烟引起心肌损伤，为适应吸烟导致的心肌缺氧，心肌中HIF-1α的表达上调，但吸烟通过抑制VEGF的表达影响了冠脉侧支循环的形成，加重对心血管系统的危害。已有临床试验表明[12]，经冠状动脉注射重组人血管内皮生长因子可使心肌血流量呈剂量依赖性改善。心肌供血量的增加能够缓解心肌缺血缺氧状态，进而改善冠心病患者预后。因此，有关VEGF的进一步研究将为具有长期大量吸烟史的冠心病患者的治疗提供了新的途径。

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The Expression of Hypoxia-Inducible Factor-1α and Vascular Endothelial Growth Factor in Cardiac Muscle Tissue of Smoked Rats

LIU Yang1 YAN Rui2 LI Xiangting1 1 Department of Internal Medicine,Affiliated Hospital of Ji’ning Medical College, Ji’ning Shandong 272100,China; 2 Department of Cardiology, The Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiao Tong University, Xi'an Shanxi 710004, China

ObjectiveTo explore the expression of hypoxia-inducible factor-1α and vascular endothelial growth factor in cardiac muscle tissue of smoked rats, and to discuss the effect of smoking on muscle tissue of rats and possible mechanism.MethodsSD rats were randomly divided into control group and experimental group, and experimental group was intervened by smoking. After 8 weeks, cardiac muscle tissue of rats was observed in morphology, and the expression of HIF-1α and VEGF were explored through immunohistochemical technique and Western Blot.ResultsCompared with control group, cardiac muscle tissue of smoked rats was arranged in disorder and sparsely, and some muscle fibril was twisty and even fractured. The expression of HIF-1α in experimental group was higher than it in control group, but the expression of VEGF in experimental group was lower than it in control group.ConclusionSmoking may damage cardiac muscle tissue of rats through increasing the expression of HIF-1α and lowering the expression of VEGF.

smoked; cardiac muscle tissue; hypoxia-inducible factor-1α;vascular endothelial growth factor

R3

A

1674-9316（2017）21-0132-05

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．21．069

国家自然科学基金面上项目（81570382）

1济宁医学院附属医院心内一科，山东 济宁 272100；2 西安交通大学第二附属医院心内科，陕西 西安 710004

李祥廷