HPLC-DAD和LC/MS/MS测定豆奶中三聚氰胺

尤 妍

(玉环市食品药品检验检测中心，浙江台州 317608)

HPLC-DAD和LC/MS/MS测定豆奶中三聚氰胺

尤 妍

(玉环市食品药品检验检测中心，浙江台州 317608)

目的：建立二极管阵列高效液相色谱仪和三重四级杆液质联用仪对豆奶中三聚氰胺的测定方法。方法：采用三氯乙酸和乙腈为提取剂、蛋白质为沉淀剂，提取液过净化柱纯化。结果：三重四级杆液质联用法对三聚氰胺的检出限为0.001 5 mg/kg，标准曲线在0.01～0.5 μg/mL范围内，R2为0.999 8，线性良好，再回收率为85 %～89 %，适用于检测低浓度的样品；二极管阵列高效液相色谱法检出限为0.024 mg/kg，标准曲线在0.5～100 μg/mL范围内，R2为0.999 9，线性良好，回收率为83 %～91 %，可以快速地对高浓度样品进行筛查。结论：以上两种检测方法结合使用，可检测0.01～100 mg/kg的三聚氰胺含量，极大地拓宽了检测范围。

二极管阵列高效液相色谱；三重四级杆液质联用；三聚氰胺；豆奶

近几年，我国豆奶行业市场消费量逐年上升，低价豆奶充斥市场，豆奶品质令人担忧。蛋白质含量是豆奶的重要营养指标，而三聚氰胺含氮量高，在豆奶中添加三聚氰胺可显著提高其蛋白含量。检测豆奶中三聚氰胺的含量能有效管控豆奶的品质，而目前对豆奶中三聚氰胺的检测鲜有报道。

检测三聚氰胺的方法主要有胶体金免疫层析法、可见近红外光谱法、高效液相色谱法、气质联用法、液质联用法等[1-11]。酶联免疫法和红外光谱法可以快速实现对三聚氰胺的定性鉴别；高效液相色谱法和气/液质联用法可对样品进行定量检测[12-14]。其中，气质联用法前处理过程复杂；高效液相色谱法快速、易操作，仪器较常见，能满足一般检测的需求，但是杂质干扰多，容易出现假阳性结果；液质联用法灵敏度高、检出限低，但是仪器价格昂贵、维修费用高。

2008年，我国制定三聚氰胺在乳与乳制品中的临时管理值：婴幼儿配方乳粉的限量值为1 mg/kg，液态奶(包括原料乳)、奶粉及其他配方乳粉的限量值为2.5 mg/kg。2012年7月5日，联合国负责制定食品安全标准的国际食品法典委员会为三聚氰胺设定了新标准，液态牛奶中三聚氰胺限量值为0.15 mg/kg。本实验研究二极管阵列高效液相色谱仪和三重四级杆液质联用仪对豆奶中三聚氰胺的测定方法，利用质谱法降低三聚氰胺的检出限，拓宽检测范围，为三聚氰胺的日常检测提供依据，为解决豆奶市场中伪劣产品带来的安全隐患提供新方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

液质联用仪由Thermo液相系统串联Thermo TSQ Quantiva 和 TSQ Endura三重四级杆质谱组成，赛默飞(世尔)科技有限公司；二极管阵列高效液相色谱仪由Agilent 1260液相系统和DAD检测器组成，安捷伦科技有限公司；梅特勒XS205DH电子天平(万分之一)，梅特勒；KQ-500DE型数控超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；美国Organomation N-EVAP-12位水浴氮吹仪；Neofuge 18R台式高速冷冻离心机，上海力申科学仪器有限公司；Milli-Q Direct 16超纯水处理器；三聚氰胺对照品，甲醇(HPLC)、乙腈(HPLC)、乙酸铵(HPLC)、辛烷磺酸钠(HPLC)、三氯乙酸(AR)、氨水(AR)、柠檬酸(AR)；阳离子交换固相萃取柱净化柱：Poly-Sery MCX。

1.2 HPLC-DAD条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；柱温：40 ℃；流速：1.0 mL/min；流动相：离子对试剂(柠檬酸、辛烷磺酸钠，pH=3)：乙腈=82∶18；检测波长：236 nm；进样量：20 μL。

1.3 LC/MS/MS条件

色谱柱：Thermo syncronis HILIC(2.1mm×100 mm，1.7 μm)；柱温：40 ℃；流速：0.2 mL/min；流动相：乙酸铵(10 mmol/L，pH=3)：乙腈=40∶60；进样量：10 μL；电喷雾离子源(ESI)，正离子检测模式，多反应检测；离子喷雾电压：4 000V；离子传输管温度：350℃；雾化温度：300℃；鞘气流速：40Arb；辅气流速：5Arb；停留时间：300ms；分辨率Q1：0.7FWHM；分辨率Q3：0.7FWHM；碰撞气压力：1.5mTorr。

1.4 样品处理

称取2.00 g样品，置于50 mL离心管中，加10 %三氯乙酸15 mL、乙腈5 mL，超声30 min，4 000 r/min离心15 min，用中速滤纸过滤后，用10 %三氯乙酸定容至25 mL；吸取10 mL，经阳离子交换固相萃取柱净化(Poly-Sery MCX)，经50 ℃水浴氮气吹干，用1 mL流动相定容，涡旋混匀1 min，过0.22 μm微孔滤膜，待测。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的确定

在豆奶中添加三聚氰胺的主要作用是增加样品的蛋白质含量，待测样品中主要含有蛋白质。三聚氰胺是强极性的小分子化合物，溶于乙腈，乙腈能沉淀蛋白质，三氯乙酸是一种强有机酸，溶于水、乙腈等，可作为蛋白质的沉淀剂，用10%的三氯乙酸和乙腈溶液能较好地提取三聚氰胺并沉淀蛋白质。

2.2 HPLC-DAD参数的选择

利用DAD对三聚氰胺进行200～400 nm波长扫描(附图)。三聚氰胺在236 nm的波长下有最大吸收峰。在210 nm处虽有最大吸收峰，但是检测波长小，样品杂质干扰多，不利于检测。综上，选择236 nm为测定波长。

附图 三聚氰胺吸收光谱

2.3 LC/MS/MS参数的选择

取1 μg/mL的三聚氰胺标准溶液，以流动注射的方式，注入带电喷雾离子源的串联质谱中，正离子模式下扫描得m/z为127的母离子，通过子离子扫描，选择2对子离子，定量离子m/z 85、碰撞能量18V；定量离子m/z 68、碰撞能量28V，并优化相关质谱参数。

2.4 标准曲线

用流动相配置不同浓度的标准溶液，分别用二极管阵列高效液相色谱仪和三重四级杆液质联用仪进行检测，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，表1结果表明，两种方法的标准曲线线性良好，R2均大于0.999，HPLC-DAD法的线性范围为0.5～80 μg/mL，LC/MS/MS法的线性范围为10～500 ng/mL，本实验可以检测三聚氰胺的浓度范围为10ng/mL～80ng/mL。

表1 不同方法制得的标准回归曲线

2.5 检出限与精密度

根据3倍信噪比×稀释倍数(2.5)/称样量(2 g)得三聚氰胺的检出限，10倍信噪比×稀释倍数(2.5)/称样量(2 g)得其定量限。分别取0.5 μg/mL和0.01 μg/mL的标准溶液分别进HPLC-DAD和LC/MS/MS分析，平行进样6次，计算三聚氰胺的保留时间精密度和峰面积精密度。表2结果表明，两种方法的保留时间和峰面积精密度均小于2 %，方法的精密度良好。HPLC-DAD法的检出限是LC/MS/MS法检出限的16倍，LC/MS/MS法能极大地降低样品的检出浓度。

表2 检出限、定量限和精密度试验结果

2.6 回收率

在空白豆奶中添加三聚氰胺标准溶液(表3)。样品中三聚氰胺含量为2～6 mg/kg时，HPLC-DAD检测的回收率为85%～89%；样品中三聚氰胺含量为0.04～0.12 mg/kg时，LC/MS/MS检测的回收率为83%～91 %。

表3 回收率试验结果

3 结论

建立了HPLC-DAD和LC/MS/MS测定豆奶中三聚氰胺的方法。利用这两种方法能简单快速检测三聚氰胺残留量，且灵敏度高，时间短。本研究利用LC/MS/MS法降低了三聚氰胺的检出限，采用质谱SRM的扫描方式进行定量分析，抗干扰能力强，适用于豆奶样品三聚氰胺含量的检测。◇

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Determination on Melamine in Soy Milk by HPLC-DAD and LC/MS/MS

YOU Yan

(The Inspection Testing Center of Food and Drug in Yuhuan City，Taizhou 317608，China)

【Objective】 To establish a method for the melamine in soy milk by HPLC-DAD and LC/MS/MS.【Method】 we used trichloroacetic acid and acetonitrile to extract and precipitate impurities.The Extraction was purificated by purification column.【Result】 Using LC/MS/MS method，the detection limit was melamine was 0.001 5 mg/kg，the calibration curves showed a good linearity in the range of 0.01～0.5 μg/mL，and the correlation coefficients(R2)was 0.999 8.The recoveries ranged from 85%～89%.The method was applicable to detect low concentration of sample.While using HPLC-DAD method，the detection limit of melamine was 0.024 mg/kg，the calibration curves showed a good linearity in the range of 0.5～100 μg/mL，and the correlation coefficients(R2)was 0.999 9.The recoveries ranged from 83%～91%.It was suitable for high concentration of the detection of the sample.【Conclusion】 The two kinds of detection methods used in combination could detect 0.01～100 mg/kg of melamine，greatly expand the detection range.

Diode Array High Performance Liquid Chromatography (HPLC-DAD)；Triple Level 4 Pole Liquid Ms(LC/MS/MS)；melamine；soy milk

尤妍(1986— )，女，硕士研究生，工程师，研究方向：食品检测。

(责任编辑 唐建敏)