化湿行瘀清热方治疗金黄地鼠颊黏膜癌前病变后HSP90α、Ki-67的表达及意义

张鹏飞，刘 健，刘铁军， 许彦枝*

(1.河北省胸科医院口腔科，河北 石家庄 050041；2.河北医科大学第四医院口腔科，河北 石家庄 050011)

·论著·

化湿行瘀清热方治疗金黄地鼠颊黏膜癌前病变后HSP90α、Ki-67的表达及意义

张鹏飞1，刘 健2，刘铁军2， 许彦枝2*

(1.河北省胸科医院口腔科，河北 石家庄 050041；2.河北医科大学第四医院口腔科，河北 石家庄 050011)

目的探讨金黄地鼠颊黏膜癌前病变经化湿行瘀清热方治疗前后热休克蛋白(heat shock protein 90α,HSP90α)、Ki-67的表达及临床意义。方法60只金黄地鼠用二羟甲基丁酸(dimethylolbutanoie acid，DMBA)丙酮溶液涂抹6周全部制作成金黄地鼠颊黏膜癌前病变的动物模型，随机分成实验组和对照组。实验组30只应用化湿行瘀清热方行灌胃疗法8周，对照组30只应用生理盐水灌胃8周，采用免疫组织化学SP法观察2组口腔黏膜的形态变化，应用染色强度评价HSP90α、Ki-67的表达水平。结果灌胃后实验组Ki-67阳性表达率为23.3%(7/30)，对照组Ki-67阳性表达率为80.0%(24/30)，2组差异有统计学意义(P<0.01)；灌胃后实验组HSP90α阳性表达率为20.0%(6/30)，对照组HSP90α阳性表达率为76.7%(23/30)，2组差异有统计学意义(P<0.01)。结论化湿行瘀清热方对DMBA诱发的金黄地鼠口腔黏膜癌前病变有一定的逆转作用。

癌前状态；热休克蛋白质类；Ki-67；化湿行瘀清热方

近年来，口腔黏膜癌前病变的发病率逐年提高。其发病原因涉及全身因素及局部因素。若口腔黏膜癌前病变可以被早期发现并进行积极治疗，往往可以取得满意的预后[1]。有研究发现化湿行瘀清热方对口腔黏膜癌前病变有特定的治疗作用[2]。二羟甲基丁酸(dimethylolbutanoieacid，DMBA)诱导的金黄地鼠颊黏膜癌是目前口腔肿瘤研究的理想模型。本研究采用DMBA诱导的金黄地鼠颊黏膜癌作为模型，模拟人口腔黏膜癌前病变的发生、发展过程，应用中药化湿行瘀清热方对金黄地鼠颊黏膜癌前病变进行处理，以免疫组织化学SP法检测其治疗前后热休克蛋白(heatshockprotein90α,HSP90α)、Ki-67的表达，旨在探讨中药化湿行瘀清热方对金黄地鼠口腔黏膜癌前病变的逆转作用，报告如下。

1 材 料 与 方 法

1.1 动物模型的建立与分组 选取金黄地鼠60只，鼠龄6周，体质量260～300g， 雌雄比例1∶1。所有实验动物单笼饲养，自由食水，在实验室适应环境2d后用于实验。实验动物由河北省实验动物中心提供，操作过程符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。60只地鼠颊黏膜用0.5%DMBA涂药，每周3次，连续涂药6周，建立口腔黏膜癌前病变动物模型。涂药后禁食、水2h，口腔癌前病变标准符合1978年WHO对口腔癌前病变的判定标准：双侧颊黏膜肉眼观全部为充血、糜烂、条索状皱折等表现，HE染色后观察可见不同程度的异常增生，表现为上皮结构异常，如过角化、粒层明显、棘层增厚、基底细胞复层、核浓染、上皮钉突肥大等。60只金黄地鼠随机分为：实验组30只，应用化湿行瘀清热方(主要由砂仁6g、佩兰10g、黄柏10g、赤芍9g、红花9g、蝉蜕10g等组成，每日1剂，分早晚2次服用)[3]灌胃治疗，所需材料购自河北医科大学第四医院中药房；对照组30只，进行生理盐水灌胃处理。

1.2 灌胃与取材方法 实验组灌胃前禁食、水8h，待动物停涂DMBA1周后，立即采取化湿行瘀清热方灌胃疗法1次/d。对照组应用生理盐水灌洗。连续灌洗8周后，将动物处死于同侧颊黏膜处切取相同大小(1.0cm×1.5cm×0.1cm)病变组织及相邻的正常黏膜组织。用10%甲醛溶液将标本固定。

1.3 免疫组织化学染色 采用免疫组织化学SP法，按试剂盒说明操作。兔抗鼠Ki-67单克隆抗体和兔抗鼠HSP90ɑ单克隆抗体购自北京中杉金桥公司。二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色，苏木精复染，封片后由2位资深病理科医师在双盲情况下评价随机的5个高倍视野，每个高倍视野计数100个细胞。然后根据半定量积分法将染色强度分为4个级别：无着色，0分；淡黄色，1分；棕黄色，2分；棕褐色，3分。根据阳性细胞的百分比分5级：<5%为0分；5%～25%为1分；>25%～50%为2分；>50%～75%为3分；>75%为4分。每张切片最后的得分为2次评分相加所得的总分[0～1分计为(-)，2～3 分计为(+)，4～5分计为(++)，6～7分计为(+++)]。以(-)定位阴性，以(+)、(++)、(+++)分别定位弱阳性、阳性和强阳性。分别设立阴性对照及阳性对照：以PBS替代一抗的正常口腔黏膜上皮染色结果作为阴性对照；以试剂自带阳性片染色结果作为阳性对照。

1.4 统计学方法 应用SPSS23.0统计软件分析数据，等级资料比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 癌前病变模型的形态变化 未经DMBA丙酮接触地鼠颊黏膜表面光滑呈淡粉色，透亮具有弹性，血管清晰，镜下观察可见角化的复层鳞状上皮，薄层结缔组织、纤维细胞及血管位于上皮和肌层之间(图 1)。经DMBA丙酮溶液接触6周后，肉眼观可见双侧颊黏膜表现为充血、糜烂，HE染色后镜下观察地鼠颊黏膜可见不同程度的异常增生，表现为上皮结构异常。可见不规则分层的上皮、丧失极性的基底细胞、核分裂次数增加、异常浅层分裂及钉突内角化珠等；细胞核变大，形状不规则且染色质增多，累及上皮层的下1/2～2/3(图 2)。结果显示，轻度异常增生24只，中度异常增生30只，重度异常增生6只。

免疫组织化学染色结果：HSP90α染色阳性呈棕黄色颗粒状，主要表达于细胞核或细胞浆(图3～5)；Ki-67染色阳性呈棕黄色颗粒状，主要表达于细胞核，胞浆为阴性(图6～8)。

图1 地鼠颊黏膜在接触DMBA之前的表现(HE染色×200)Figure1 Buccalmucosaofthecasesbe-forethecontactofDMBA(HE×200)图2 地鼠颊黏膜在接触DMBA之后的表现(HE染色×200)Figure2 BuccalmucosaofthehamstersaftercontactofDMBA(HE×200)图3 接触DMBA溶液之后HSP90α的表达(免疫组织化学×200)

Figure3TheexpressionofHSP90αaftercontactofDMBA(SP×200)

图4化湿行瘀清热方灌胃治疗后HSP90α的表达(免疫组织化学×200)

Figure4TheexpressionofHSP90αaftergavageofHuashiXingyuQingredecoction(SP×200)

图5生理盐水灌胃治疗后HSP90α的表达(免疫组织化学×200)

Figure5TheexpressionofHSP90αaftergavageofsaline(SP×200)

图6接触DMBA溶液之后Ki-67的表达(免疫组织化学×200)

Figure6TheexpressionofKi-67aftercontactofDMBA(SP×200)

图7化湿行瘀清热方灌胃治疗后Ki-67的表达(免疫组织化学×200)

Figure7TheexpressionofKi-67aftergavageofHuashiXingyuQingredecoction(SP×200)

图8生理盐水灌胃治疗后Ki-67的表达(免疫组织化学×200)

Figure8TheexpressionofKi-67aftergavageofsaline(SP×200)

2.2 2组地鼠治疗前后Ki-67和HSP90α表达 2组地鼠接触DMBA丙酮溶液成模后(治疗前)，实验组Ki-67阳性表达率为80.0%(24/30),对照组Ki-67阳性表达率为76.7%(23/30)，2组差异无统计学意义(P>0.05)；灌胃后实验组Ki-67阳性表达率为23.3%(7/30)，对照组Ki-67阳性表达率为80.0%(24/30)，2组差异有统计学意义(P<0.01)。2组地鼠接触DMBA丙酮溶液成模后(治疗前)，实验组HSP90α 阳性表达率为70.0%(21/30)，对照组HSP90α阳性表达率73.3%(22/30)，2组差异无统计学意义(P>0.05)；灌胃后实验组HSP90α阳性表达率为20.0%(6/30)，对照组HSP90α阳性表达率为76.7%(23/30)，2组差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 2组经DMBA丙酮液体处理后SP90α和Ki-67表达情况Table 1 The expression of HSP90α and Ki-67 in two groups after the treatment of DMBA-acetone (n=30，例数)

3 讨 论

口腔黏膜癌前病变是指细胞异常增生，具有恶性变化倾向。其发病与局部因素(吸烟、喜饮烈性酒、咀嚼槟榔、不良修复体、残根残冠的锐利边缘对局部黏膜的机械刺激)的长期刺激以及某些全身因素(念珠菌感染、微量元素缺乏、微循环改变、易感的遗传素质、脂溶性维生素缺乏等)有关。由于口腔黏膜癌前病变原因不明且易导致癌变，故早期对口腔黏膜癌前病变进行处理尤为重要。

目前，对于口腔黏膜癌前病变尚无特效治疗方法，尤其是对于病变部位多发或病变面积较大的患者。西医疗效不稳定，仅能缓解临床症状，无法从根本上解决问题。近年来，某些中草药在治疗口腔黏膜癌前中发挥了显著的作用。国内部分学者对单玄口胶、1023中药合剂、复方半枝莲、复方绞股蓝、增生平、灯盏细辛等中成药及天然胡萝卜素、大蒜、芦荟、螺旋藻等天然保健食品防治口腔癌前病变作用进行了相应的研究[4]。化湿行瘀清热方有清热燥湿、健脾化湿、清热凉血、质轻善散、止痒等功效。其中蝉蜕除含有17种氨基酸外，还包含多种人体不可缺少的微量元素，对促进口腔黏膜病变有特定的作用[5]；黄柏清热凉血、健脾化湿，有抑菌抗炎、促进组织愈合的功效；佩兰解热清暑、健脾利湿，具有抗炎杀菌作用；甘草可以去除不正之气及泻火，健脾胃而和中，解百毒，协和诸药；丹参、赤芍等可通过调节机体内部免疫系统达到自稳的状态[3]，赤芍还可以在一定程度上降低血液黏度，改善微循环及血管通透性，进而促进上皮细胞的修复。化湿行瘀清热方的上述优点对口腔黏膜癌前病变有一定的治疗作用。

HSP90α基因位于人类染色体14q32.33，有11个外显子，其编码产物是732个氨基酸的蛋白质，相对分子质量为90 000。HSP90α的主要生物学功能包括“分子伴侣”作用、在细胞调节的“多成分伴侣”途径中的作用、体外ATP酶活性及自我磷酸化作用、免疫功能和抗凋亡与凋亡调节作用等。其中免疫功能和抗凋亡、凋亡调节作用与肿瘤的发生密切相关[6-8]。作为肿瘤治疗的一个重要靶点，HSP90α蛋白在维持多种肿瘤蛋白的正常结构、功能和稳定性方面均发挥着不可替代的作用。

Ki-67是在增殖细胞中表达的一种核抗原，基因位于10号染色体上[9-10]。它是一个大分子质量的蛋白，在除G0期外的细胞周期内表达，于细胞周期启动时开始增加，在S期的后半部分表达显著增强，于G2和M期达到峰值，在有丝分裂结束后又迅速下降[11-12]。其与细胞增殖过程有关。在人类诸多癌前病变中，均存在Ki67过度表达的现象[13]。因此，许多学者推断Ki-67是人类所有增殖细胞中普遍存在的标志性抗原，且对组织细胞恶变的识别具有一定的意义。

本研究应用免疫组织化学方法检测了HSP90α、Ki-67在各组中的表达情况。正常地鼠颊黏膜HSP90α、Ki-67的阳性表达主要见于基底细胞层[14-15]。DMBA致癌6周后，HSP90α、Ki-67的表达由基底层逐渐扩展至棘层，乃至上皮全层，进而使得HSP90α、Ki-67阳性表达率明显升高，这种现象的发生与DMBA作用后上皮组织学变化的类型有关[16-17]。中药化湿行瘀清热方灌胃治疗后HSP90α、Ki-67的阳性表达明显降低，而生理盐水灌胃治疗后HSP90α、Ki-67阳性表达无明显变化。表明化湿行瘀清热方对金黄地鼠颊黏膜癌前病变有一定的逆转作用。有研究发现HSP90α、Ki-67的表达与口腔黏膜癌前病变治疗的进程呈正相关性[18]，但其具体作用机制尚有待于进一步深入探讨。

总之，中药化湿行瘀清热方对DMBA诱发的金黄地鼠口腔癌前病变有一定的逆转作用，其作用机制还不完全清楚，但随着分子生物学技术和蛋白质组学在中药研究方面的应用，中药化湿行瘀清热方的作用机制将会更明了。

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(本文编辑：许卓文)

TheexpressionsandsignificanceofHSP90αandKi-67ingoldenhamsterbuccalmucosaprecancerouslesionsafterHuashiXingyuQingredecoctiontreatment

ZHANGPeng-fei1,LIUJian2,LIUTie-jun2,XUYan-zhi2*

(1.DepartmentofStomatology,theChestHospitalofHebeiProvince,Shijiazhuang050041,China; 2.DepartmentofStomatology,theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

ObjectiveTo investigate the expressions and significance of heat shock protein 90α, HSP90α)and Ki-67 in hamster buccal mucosa precancerous lesions after Huashi Xingyu Qingre decoction treatment.MethodsSixty golden hamster models of buccal mucosa precancerous lesions were established after the contact of dimethylolbutanoie acid(DMBA) for six weeks. They were randomly divided into experimental and control groups. Thirty rats of experimental group were received gavage therapy of Huashi Xingyu Qingre decoction for 8 weeks, while, the other thirty rats of control group were received normal saline treatment for 8 weeks. The expression levels of HSP90α、Ki-67 were assessed by dyeing intensity of streptavidin-perosidase(SP).ResultsThe positive expression rate of Ki-67 after gavage was 23.3%(7/30) in the experimental group and 80.0%(24/30) in the control group(P<0.01). The positive expression rate of HSP90α after gavage was 20.0%(6/30) in the experimental group and 76.7%(23/30) in the control group(P<0.01).ConclusionHuashi Xingyu Qingre decoction is conspicuously effective in the reversal of DMBA-induced precancerous lesions in the hamster buccal mucosa.

precancerouslesions;heat-shockproteins;Ki-67;HuashiXingyuQingredecoction

R730.21

A

1007-3205(2017)10-1180-05

2017-02-17；

2017-04-18

河北省中医药管理局科研计划(2016175)

张鹏飞(1981-)，男，山西运城人，河北省胸科医院主治医师，医学硕士，从事口腔修复研究。

*通讯作者。E-mail：xu_yanzhi@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.10.015