怀山药中甲基硫菌灵及其代谢物多菌灵残留测定及安全性评价*

焦 强,王艳艳,李华妮，葛文静

(1.河南省口岸食品检验检测所，河南 郑州 450003； 2.河南省中医药研究院，河南 郑州 450004)

·药学研究·

怀山药中甲基硫菌灵及其代谢物多菌灵残留测定及安全性评价*

焦 强1,王艳艳2,李华妮2，葛文静2

(1.河南省口岸食品检验检测所，河南 郑州 450003； 2.河南省中医药研究院，河南 郑州 450004)

目的：研究了甲基硫菌灵及其代谢物多菌灵在怀山药根茎的消解动态和最终残留。方法：采用HPLC法, Luna C18色谱柱，流动相为甲醇-四氢呋喃-水(43∶2∶55), 检测波长267 nm(甲基硫菌灵)、277 nm(多菌灵)。对山药根茎中的多菌灵残留量进行检测，对其数据用DAS 2.0软件按照非房室模型统计矩参数分析。结果：多菌灵在1.222～122.200 ng时,r=1.000 0,呈良好的线性关系；甲基硫菌灵在0.786～78.600 ng时,r=0.999 7,呈良好的线性关系。山药中甲基硫菌灵的添加回收率在82.5%～84.9%之间，RSD 2.91%～7.64%；山药中多菌灵的添加回收率在88.3%～92.8%之间，RSD 3.02%～7.90%。施药后，甲基硫菌灵在山药中未检出，其转化为多菌灵，并在植物中消解代谢。甲基硫菌灵施用量为11.25 kg/hm2时，多菌灵的半衰期为10.20 d，Tmax 2.0 d，Cmax 0.72 μg/g；甲基硫菌灵施用量为22.50 kg/hm2时，多菌灵的半衰期为7.81 d，Tmax 2.0 d，Cmax 0.58 μg/g；甲基硫菌灵施用量为45.00 kg/hm2时，多菌灵的半衰期7.57d, Tmax 1.7d，Cmax 0.44 μg/g。 甲基硫菌灵及其代谢物多菌灵在山药根茎中最终残留量均低于0.02 μg/g。 结论:山药根茎中甲基硫菌灵及代谢物多菌灵动态消解，并在30 d内全部消解。

怀山药；甲基硫菌灵/测定；多菌灵/测定；残留；高效液相色谱

山药为薯蓣科植物薯蓣DioscoreaoppositaThunb.的干燥根茎。怀山药是山药的道地药材，其多糖等含量高于非道地山药 ,比普通淮山药的营养与药用价值高。炭疽病(anthracnose)是怀山药的主要病害之一，主要危害山药的茎、叶，也可危害叶柄和零余子，严重时可造成叶片枯死、脱落，甚至整株死亡，以致绝产。甲基硫菌灵是一种广谱性内吸性低毒杀菌剂，对山药炭疽病前期、中期均有良好效果，怀山药道地药材区普遍施用甲基硫菌灵农药[1-3]。甲基硫菌灵不稳定，在通过山药的叶、茎吸收后，代谢为多菌灵，并缓慢消解。笔者通过对种植的怀山药喷洒甲基硫菌灵研究甲基硫菌灵和多菌灵的残留的变化，为甲基硫菌灵在怀山药生产中的安全性评价提供参考依据[4]。

1 药品、试剂与仪器

甲基硫菌灵标准品，纯度≥99.2%，由国家农药质量监督检验中心提供，批号20081228；多菌灵标准品，纯度≥99.2%，由国家农药质量监督检验中心提供，批号20081229。甲醇，为色谱纯，德国Merck公司产品，批号603-001-X；水为高纯水；其他试剂均为分析纯。Waters 2695-996型高效液相色谱仪，美国Waters公司产品。

2 方法与结果

2.1 样品种植、施药与采摘

供试山药采用传统种植的垆土铁棍山药。实验地设在温县岳村乡韩郭作村山药规范化种植试验田。地块为新茬地，660 m2，每小区15 m2，3次重复，共28个小区(含清水对照)，随机排列，小区间设保护行距。山药为两年生，按种植计划在霜降前后采收。根据推荐剂量设计此次施药的甲基硫菌灵质量分数为2,4,8 g/L,即施用量分别为11.25，22.50，45.00 kg/hm2，3个施药水平设3个重复小区，面积3 m×10 m，保护行距2 m。并设一个空白对照小区，面积30 m2。计划在7月底8月初喷药，之后按照如下采收间隔进行：0(施药后药液基本风干的2 h内)，1，2，3，5，7，14，21，30 d，一共9次。按“S”法采集样品，所采样品为全株，采样后立刻包装好，于低温冰箱中保存备用[5]。

2.2 样品处理

称取样品30.00 g放入匀浆机中，加入丙酮100 mL匀浆，用丙酮洗涤匀浆机；匀浆液合并洗液，移至250 mL锥形瓶中；超声处理30 min，滤过；滤渣用丙酮超声处理2次，每次40 mL，超声处理15 min，滤过；滤液合并，用真空旋转浓缩器35℃浓缩至近干，以2.0 mL甲醇∶二氯甲烷(3∶97)溶解残渣，待净化。取PSA固相萃取小柱，用5.0 mL甲醇∶二氯甲烷(3∶97)淋洗小柱，弃去淋洗液；当溶剂液面达到小柱吸附层表面时，立即将上述提取液加入柱中，用甲醇∶二氯甲烷(3∶97)10 mL洗脱；收集洗脱液到10 mL离心管中；将离心管置氮吹仪上，水浴35 ℃，用氮气吹至近干；残渣甲醇溶解定容至2 mL，过0.22 μm 滤膜，待测[6]。

2.3 色谱条件

色谱柱为Luna C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-四氢呋喃-水(43∶2∶55)；流速1.0 mL/min；甲基硫菌灵的检测波长为267 nm，多菌灵的检测波长为277 nm；甲基硫菌灵的保留时间为9.09 min，多菌灵的保留时间为6.35 min；柱温30 ℃[7]。

2.4 标准曲线与仪器检出限

精密称取甲基硫菌灵7.86 mg，用甲醇稀释成78.6 mg/L；另精密称取多菌灵12.22 mg，用甲醇稀释成122.2 mg/L，分别进样1，5，10，25，100μL测定。结果：甲基硫菌灵在0.786～78.6 ng内有良好线性关系，标准曲线回归方程Y=12 231X+121.7，r=0.999 7，检出限0.422 ng,方法的最小检出质量分数1.33 ng/g。多菌灵在1.222～122.2 ng内有良好线性关系，标准曲线回归方程Y=18 937X-413.4，r=1.000 0 ，检测限0.561 ng，方法的最小检出质量分数1.83 ng/g。见图1。

A.甲基硫菌；B.多菌灵；C.样品图1 甲基硫菌灵、多菌灵、样品色谱图

2.5 精密度试验

精密吸取甲基硫菌灵和多菌灵对照品溶液10 μL，连续进样5次，测定峰面积。结果：甲基硫菌灵RSD为0.06%，多菌灵RSD为0.04%。结果表明：仪器进样精密度良好。

2.6 稳定性试验

取新制备的供试溶液，在0,2,4,8,16,24 h分别进样10 μL，测定峰面积。结果：甲基硫菌灵的RSD为1.88%，多菌灵RSD为0.31%。结果表明：供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

取同一批样品6份，照2.2项下方法制备供试液，进行测定。结果：甲基硫菌灵RSD为3.75%，多菌灵RSD为2.38%。结果表明：重复性良好。

2.8 回收率试验

精密称取未喷洒农药的山药样品15份，每批5份，分为3批，分别加入一定量(3个梯度浓度)的甲基硫菌灵和多菌灵对照品溶液，照2.2项下方法制备供试液，进行测定，结果见表1。

表1 甲基硫菌灵和多菌灵在山药中的回收率

2.9 多菌灵与甲基硫菌灵残留测定结果

山药根茎部分未检出甲基硫菌灵，检出多菌灵，其数据采用DAS 2.0软件按照非房室模型统计矩参数分析。结果：甲基硫菌灵施用量为11.25 kg/hm2时，多菌灵的半衰期为10.20 d，Tmax 2.0 d，Cmax 0.72 μg/g；甲基硫菌灵施用量为22.50 kg/hm2时，多菌灵的半衰期为7.81 d，Tmax 2.0 d，Cmax 0.58 μg/g；施用量甲基硫菌灵施用量为45.00 kg/hm2时，多菌灵的半衰期7.57d, Tmax 1.7d，Cmax 0.44 μg/g。 最终残留试验结果显示，甲基硫菌灵及代谢物多菌灵在山药根茎中最终残留量均低于0.02 μg/g。 见表2、图2。

表2 多菌灵在山药中的消解动态

图2 多菌灵在山药中的消解动态

3 讨 论

本实验结果表明：本方法快速简单，灵敏度高，重现性好，能保证甲基硫菌灵和多菌灵的检测数据可靠。甲基硫菌灵经山药茎叶吸收后很快被代谢，在其地下根茎中以多菌灵形式存在。本实验中，山药根茎未检出甲基硫菌灵而检出多菌灵也充分证明了这一点。施用不同质量分数甲基硫菌灵样品的多菌灵残留有差别,但不明显。施药后2 d，山药根茎处的多菌灵含量达到最高值，之后缓慢降解；到14 d，降至约0.2 μg/g。

目前我国、国际食品法典委员会、欧盟和日本均未对山药中多菌灵的农药残留进行规定,本次结果具有参考意义。建议山药的甲基硫菌灵的施用量为45.00 kg/hm2，采收间隔期14 d以上，能保证山药根茎中甲基硫菌灵和多菌灵农药残留量较安全[8]。

[1]张帅.祁山药炭疽病的病原鉴定、生物学特性及药剂防治研究[D].保定：河北农业大学,2013.

[2]周玥,郭华,周洁.铁棍怀山药中主要营养成分的研究[J].中国食物与营养,2011,17(3):69-71.

[3]张重义,谢彩侠,黄晓书,等.怀山药道地产区与非道地产区药材质量比较[J].现代中药研究与实践,2003, 17(1):19-21.

[4]陈伟,朱盈蕊,刘红彦, 等.苯并咪唑类杀菌剂残留分析方法研究进展[J].浙江农业科学,2011,52(3):623-629.

[5]田金改,金红宇,彭方,等.多菌灵在人参生长期的残留动态研究[J].中草药,2006, 37(9):1413-1415.

[6]曹爱华,李义强,徐光军, 等.高效液相色谱法同时测定烟草中吡虫啉、多菌灵、甲基硫菌灵的残留量[J].中国烟草科学,2009,30(1):31-34.

[7]彭方,田金改,金红宇, 等.高效液相色谱法测定人参中多菌灵农药残留含量[J].中国药学杂志,2007,42(6):475-477.

[8]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，中华人民共和国农业部，国家食品药品监督管理总局.GB2763-2016 食品安全国家标准：食品中农药最大残留限量[S].北京：中国标准出版社，2016.

1001-6910(2017)10-0069-04

R284

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.10.29

国家十一五科技支撑计划项目“中药材资源与生产标准规范”(2006BAI21B07)

2017-07-04；

2017-08-21

(编辑 陶 珠)