炮天雄和刨附片对小鼠免疫功能的影响

李梦婷，胡婷婷，熊秋韵，缪璐琳，谢晓芳，彭成

·药理毒理·

炮天雄和刨附片对小鼠免疫功能的影响

李梦婷，胡婷婷，熊秋韵，缪璐琳，谢晓芳，彭成

目的：探讨炮天雄与刨附片对小鼠免疫功能的影响。方法：采用标准物提取法制备炮天雄、刨附片水煎液。取正常小鼠，分组后，给予灌胃炮天雄或刨附片5.0、2.5、1.25 g．kg-1，连续30天或15天，应用碳粒廓清实验或脏器指数实验，考察炮天雄和刨附片对正常小鼠的非特异性免疫；此外，用不同剂量的炮天雄、刨附片水煎液灌胃免疫抑制小鼠11天，测定小鼠碳粒廓清吞噬能力、外周血细胞水平及肝、脾、胸腺脏器指数。结果：刨附片5.0 g．kg-1能显著提高正常小鼠碳粒廓清指数K（P＜0.05）；炮天雄5.0、2.5、1.25 g．kg-1和刨附片5.0、2.5、1.25 g．kg-1对免疫低下小鼠的胸腺指数、脾指数均有升高趋势；刨附片2.5 g．kg-1能显著性升高免疫低下小鼠的肝脏指数（P＜0.05）。结论：刨附片和炮天雄对正常小鼠和免疫低下小鼠有一定增强非特异性免疫功能的作用。

炮天雄；刨附片；免疫调节；非特异性免疫

附子（Radix Aconiti Lateralis Preparata）来源于毛茛科乌头属植物乌头Aconitum carmichaeliDebx.的子根加工品[1]。附子药用历史悠久，是传统的有毒中药，随着其毒性物质基础和作用机制的揭示，人们掌握了其减毒和控毒的方法[2]，从而指导临床合理、安全使用。附子属温里药，具有回阳救逆，补火助阳，散寒止痛的功效。现代药理和临床研究显示，附子散寒止痛的作用与提高机体免疫功能有关。与之同时，现代炮制技术发展的介入，附子的炮制品种也不断增加，其中附子新的炮制品——炮天雄、刨附片，是拟作为保健饮片的附子新产品，用以温阳补肾。然而，按照目前保健功能的分类两者的功能暂不清晰，有关二者的药理研究报道罕见。增强免疫功能可能是炮天雄和刨附片的保健功能之一，故本实验拟采用正常小鼠和免疫低下小鼠模型，初步探究炮天雄和刨附片对免疫功能的作用。

1 材料

1.1 药物

刨附片，炮天雄，均由四川好医生攀西药业有限公司提供。使用文献法[3]制备成刨附片浓水煎液和炮天雄浓水煎液，-20℃储存，实验前将刨附片和炮天雄浓溶液用纯净水分别稀释至高剂量组0.50 g．mL-1，中剂量组0.25 g．mL-1，低剂量组0.125 g．mL-1，待用。阳性药物：人参总皂苷，由四川好医生攀西药业有限公司提供；气血康口服液，云南白药集团文山七花有限责任公司，批号WKB1505。注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号14032625。

1.2 动物

昆明种小鼠，SPF级，体重为(20±2)g或(15±2)g，由四川省中医药科学院提供，动物质量合格证号：SCXK（川）2013-19，检疫后备用。

实验环境：成都中医药大学国家中医药管理局中药药理科研三级实验室(TCM-2009-315)。

1.3 仪器

紫外可见分光光度计(美国安捷伦，G1103a)，全波长多功能读数仪（美国T h e r m o公司，VARIOSKAN FLASH 2.4.3）；血细胞分析仪（日本光电仪器公司，MEK-6218K型）；1/10万电子天平(日本岛津，AU W220D型）；超纯水仪(美国Millipore，Milli-Q Integral 3)；电子秤(中国衡展，K-100DCH)；96孔细胞培养板（美国 CORNING 公司）。

1.4 试剂

中华墨汁（北京一得阁墨业有限责任公司）；柠檬酸三钠（成都市科龙化工试剂厂，批号20101026）；碳酸钠（成都天华科技股份有限公司，批号20051111）；生理盐水（四川科伦药业股份有限公司，批号M13082210）。

2 方法

2.1 正常成年小鼠碳粒廓清指数K和吞噬指数α测定

取体重为(20±2)g健康昆明种小鼠，适应环境后按体重分层随机分为空白组、人参总皂苷组、刨附片高剂量组、刨附片中剂量组、刨附片低剂量组、炮天雄高剂量组、炮天雄中剂量组、炮天雄低剂量组，各组小鼠10只，雌雄各半。刨附片高、中、低剂量组分别给予刨附片水煎液5.00 g．kg-1、2.50 g．kg-1、1.25 g．kg-1每日灌胃1次，炮天雄高、中、低剂量组分别予炮天雄水煎液5.00 g．kg-1、2.50 g．kg-1、1.25 g．kg-1每日灌胃1次，人参总皂苷组灌胃人参总皂苷2.50 g．kg-1，空白对照组给予纯净水10 mL．kg-1，每日1次，连续30天。于末次给药0.5 h后，对小鼠尾静脉注射25%墨汁（0.1 mL．(10g)-1），注入后立即计时，分别于2 min、10 min时从小鼠眼后静脉丛取血0.02 mL，立即将血液加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，用紫外分光光度计在550 nm处测光密度值（OD）。然后将小鼠处死，取小鼠的肝脏和脾脏，并用滤纸吸干表面的血液，用电子天平称其重量，按下列公式计算碳粒廓清指数K和吞噬指数α值，统计数据，进行分析[4～6]。

K=(LogOD1-LogOD2)/（t2-tl）(ODl，OD2分别为吸光度，t为时间)

α=体重/(肝重+脾重)×K1/3

2.2 幼年小鼠免疫器官脏器指数测定

取体重为(15±2)g健康昆明种小鼠80只，雌雄各半。分组与给药同“2.1”，每日灌胃1次，连续给药15天。末次给药1h后，称取小鼠体重，脱颈椎处死小鼠，解剖取脾、肝精密称重，计算小鼠的脾指数和肝指数。比较给药组与空白组各脏器指数。脏器指数计算方法：

脏器指数=脏器重量(mg)/小鼠体重(g)

2.3 免疫低下模型小鼠免疫功能测定

取体重为(20±2)g健康昆明种小鼠90只，适应环境后按体重分层随机分为空白组、模型组、气血康口服液组、刨附片高剂量组、刨附片中剂量组、刨附片低剂量组、炮天雄高剂量组、炮天雄中剂量组、炮天雄低剂量组，各组小鼠10只，雌雄各半。各组小鼠灌胃相应药液，10 mL．kg-1，每日1次，连续11天。除空白组外，其余各组于灌胃第1、3、5、7、9天，在灌胃前给予皮下注射环磷酰胺50 mg．kg-1。隔日称重1次。分别于第5天和第10天给药1.0 h后，各组小鼠眼后静脉丛取血，采用血细胞分析仪测定外周血中白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）数量。第11天给药0.5 h后，对小鼠尾静脉注射25%墨汁（0.1 mL．(10g)-1），注入后立即计时，分别于2 min、10 min时从小鼠眼后静脉丛取血0.02 mL，立即将血液加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，采用全波长多功能读数仪在550 nm处测光密度值（OD ）。称量小鼠体质量，颈椎脱臼处死小鼠，分离肝脏、胸腺及脾脏并称重，按公式计算碳廓清指数K、吞噬指数α和免疫器官脏器指数。

2.4 数据统计

数据采用SPSS18．0统计软件处理，计量资料以均数±标准差(±S)表示，组间比较采用单因素分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对正常小鼠碳粒廓清指数K和吞噬指数α的影响

人参总皂苷组和刨附片高剂量组小鼠的碳粒廓清指数K显著高于空白对照组（P＜0.05）。此外，炮天雄高、中剂量组和刨附片中、低剂量组表现出增强小鼠吞噬功能的趋势。

表1 炮天雄和刨附片对成年小鼠碳粒廓清指数K和吞噬指数α的影响±S,N=10)

表1 炮天雄和刨附片对成年小鼠碳粒廓清指数K和吞噬指数α的影响±S,N=10)

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别剂量(g．kg-1)Kα空白组-0.0140±0.00894.55±0.59人参总皂苷组2.500.0318±0.0149*5.56±1.04炮天雄高剂量组5.000.0181±0.00914.70±0.83炮天雄中剂量组2.500.0140±0.00564.44±0.22炮天雄低剂量组1.250.0240±0.01214.90±1.47刨附片高剂量组5.000.0262±0.0226*5.10±0.38刨附片中剂量组2.500.0217±0.00965.08±0.56刨附片低剂量组1.250.0203±0.00714.88±0.55

3.2 对幼年小鼠免疫器官脏器指数的影响

人参总皂苷组和试验组与空白对照组比较，无显著性差异（P＞0.05）。人参总皂苷组表现出肝指数大于空白对照组的趋势（P＞0.05）；试验组中，炮天雄高、中、低剂量组和刨附片高、中、低剂量组肝指数均低于空白对照组，但无显著性差异（P＞0.05）。人参总皂苷组和炮天雄中、低剂量组脾指数低于空白对照组，炮天雄高剂量组和刨附片高、中、低剂量组均高于空白对照组，均无显著性差异（P＞0.05）。

表2 炮天雄和刨附片对小鼠免疫器官的脏器指数的影响(±s,N=10)

表2 炮天雄和刨附片对小鼠免疫器官的脏器指数的影响(±s,N=10)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别剂量(g．kg-1)肝指数(mg．g-1)脾指数(mg．g-1)空白组-52.35±3.304.89±0.84人参总皂苷组2.5054.02±4.214.43±0.62炮天雄高剂量组5.0049.31±3.864.97±0.76炮天雄中剂量组2.5050.15±3.803.69±0.57炮天雄低剂量组1.2551.42±3.793.81±0.55刨附片高剂量组5.0049.41±4.825.53±0.81刨附片中剂量组2.5050.01±4.254.14±0.92刨附片低剂量组1.2550.53±4.083.80±0.58

3.3 对免疫低下小鼠免疫功能的影响

3.3.1 对血细胞数的影响 模型组小鼠的白细胞数、血小板数显著低于正常组（P＜0.05）。与模型组比较，炮天雄低剂量组、刨附片各剂量组具有升高白细胞数的趋势；刨附片低剂量组具有降低血小板数的趋势。

表3 炮天雄和刨附片对免疫低下小鼠血细胞数的影响(±S,N=10)

表3 炮天雄和刨附片对免疫低下小鼠血细胞数的影响(±S,N=10)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

RBC(1012/L)WBC(109/L)HGB(g/L)PLT(109/L)给药第6天给药第10天给药第6天给药第10天给药第6天给药第10天给药第6天给药第10天空白组-5.36±1.30**6.04±1.108.41±1.868.47±1.27119.89±25.37 127.33±18.98249.89±73.03**313.44±29.62**模型组-1.54±0.551.85±0.578.29±0.828.36±0.41126.60±11.69125.90±8.02355.20±94.80434.80±100.72气血康口服液组2.501.66±0.541.67±0.708.53±0.578.07±0.96128.90±6.59120.90±13.18421.00±80.08421.90±82.35炮天雄高剂量组5.001.57±0.481.93±0.797.90±0.718.26±0.71122.00±14.85 121.89±13.13357.89±56.69405.00±99.42炮天雄中剂量组2.501.58±0.391.90±0.417.86±0.578.07±0.59121.70±9.70120.50±10.01439.33±84.40416.78±74.45炮天雄低剂量组1.251.46±0.482.11±0.947.97±0.837.78±1.04123.00±10.59 115.40±14.28402.80±90.00393.30±61.68刨附片高剂量组5.001.59±0.292.45±0.598.66±0.628.33±0.68126.88±7.60122.38±8.70374.75±67.60430.38±97.05刨附片中剂量组2.501.33±0.222.04±1.088.46±0.468.27±0.62126.50±5.79120.80±10.26418.10±84.07459.60±42.09刨附片低剂量组1.252.13±0.68*1.96±0.418.39±0.548.34±0.82128.10±9.57122.10±12.57384.80±93.12393.60±98.65组别剂量(g．kg-1)

3.3.2 对碳粒廓清指数K和吞噬指数α的影响 在本实验中，环磷酰胺致免疫低下模型小鼠并未表现出碳粒廓清指数K和吞噬指数α下降，与空白组比较无显著性差异。给药组与模型组比较无明显差异。

表4 炮天雄和刨附片对免疫低下小鼠碳粒廓清指数K和吞噬指数α的影响(±S,N=10)

表4 炮天雄和刨附片对免疫低下小鼠碳粒廓清指数K和吞噬指数α的影响(±S,N=10)

组别剂量(g．kg-1)Kα空白组-0.0062±0.00333.41±0.70模型组-0.0083±0.00323.68±0.43

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3.3 对免疫低下小鼠肝、脾、胸腺脏器指数的影响 模型组小鼠的胸腺指数、脾指数显著低于正常组（P＜0.05）。给药组与模型组比较并未有显著性差异，炮天雄与刨附片各剂量表现出升高免疫低下胸腺指数和脾指数的趋势；气血康口服液组、刨附片中剂量组与模型组比较，能显著升高肝脏指数（P＜0.05）。

表5 炮天雄和刨附片对免疫低下小鼠脏器指数的影响(±S,N=10)

表5 炮天雄和刨附片对免疫低下小鼠脏器指数的影响(±S,N=10)

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

肝脏指数(mg．g-1)空白组-3.58±0.73**3.41±0.65**48.92±4.97模型组-1.19±0.341.80±0.1750.36±3.00气血康口服液组2.501.39±0.502.03±0.6554.30±3.20*炮天雄高剂量组5.001.87±0.522.09±0.3450.33±3.38炮天雄中剂量组2.501.53±0.442.06±0.2149.66±3.41炮天雄低剂量组1.251.67±0.232.05±0.3550.58±2.66刨附片高剂量组5.001.46±0.572.15±0.5252.13±2.05刨附片中剂量组2.501.38±0.182.03±0.3154.46±2.58*刨附片低剂量组1.251.28±0.381.98±0.3449.81±3.39组别剂量(g．kg-1)胸腺指数(mg．g-1)脾指数(mg．g-1)

4 讨论

附子为“回阳救逆第一品药”，散寒作用可以理解为与增强免疫系统功能、镇痛、增加血氧等作用相关。随着人们对附子的深入研究，发现附子及其不同炮制品能对体液免疫和细胞免疫均有不同程度的调节作用[7-14]。

单核巨噬细胞的吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的重要指标之一[15]。巨噬细胞的碳粒廓清指数K和校正吞噬指数α的大小可以反映内皮网状系统吞噬功能的强弱；当细菌、病毒等抗原性物质进入机体后，可迅速被单核巨噬系统吞噬和清除，吞噬速度越快则机体非特异性免疫功能越强大。实验结果显示，刨附片5.0 g．kg-1在实验条件下表现出显著性的提高小鼠碳粒廓清指数，与空白对照组比较这一差异具有显著性（P＜0.05）。

环磷酰胺是临床上常用的抗肿瘤药物之一，是一种细胞毒性药物，可损伤机体的免疫器官，抑制机体的体液免疫和细胞免疫，可使脾脏指数降低[16]，使白细胞、血小板减少，贫血[17]。本实验采用环磷酰胺诱导免疫低下小鼠模型，结果显示其白细胞和血红蛋白减少，胸腺指数、脾脏指数降低。本实验中，炮天雄组、刨附片对免疫低下小鼠的胸腺指数、脾指数有升高作用趋势，刨附片中剂量组对免疫低下小鼠的肝脏指数有升高，提示炮天雄和刨附片具有一定增强免疫功能作用。此外，在前期研究中对二者开展了急性毒性研究，结果显示，刨附片、炮天雄水煎液灌胃小鼠均无明显急性毒性，最大给药量分别为25.2、27.2 g．kg-1[18]。故而，炮天雄和刨附片可作为增强免疫保健品的潜在资源。

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（责任编辑：李芸霞）

Immunoregulation effect of Pao Tianxiong and Bao Fupian in mice/

LI Meng-ting, HU Ting-ting, XIONG Qiu-yun, MIAO Lu-lin, XIE Xiao-fang, PENG Cheng// (School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan )

Objective:To observe the immunoregulatory effect of Pao tianxiong (PTX) and Bao Fupian (BFP).Method:The water decoction of PTX and BFP were prepared using standard extracts method. After grouping mice，different groups were given PTX or BFP in the doses of 5.0 g．kg-1, 2.5 g．kg-1, 1.25 g．kg-1for 30 days or 15days. Carbon clearance test and immune organ index were used to inspect the effect of PTX and BFP on non-speci fi c immunity on normal mice. Moreover, immunosuppression mice were gavaged in different doses of PTX and BFP for 11 days. The immunity indices such as macrophage phagocytosis,peripheral blood cell levels and immune organ indices were tested.Result:5.0 g．kg-1BFP can signi fi cantly increase the carbon clearance index K in normal mice (P＜0.05). PTX in the doses of 5.0, 2.5, 1.25 g．kg-1and BFP in the doses of 5.0, 2.5, 1.25 g．kg-1had a trend of increasing thymus index and spleen index in immunosuppression mice. 2.5 g．kg-1BFP signi fi cantly increased liver index in immunosuppression mice (P＜0.05).Conclusion:BFP and PTX have certain effect on strengthening the immune function both in normal mice and immunosuppression mice.

Pao tianxiong; Bao Fupian; immunoregulation; non-speci fi c immunity

R 285.5

A

1674-926X(2017)03-013-04

国家自然科学基金人才培养项目(NO:J1310034)：成都中医药大学中药基础基地科研训练及科研能力提高项目（KY2015-001）。

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

李梦婷(1993-)，女，中药药理学博士研究生在读，研究方向中药药理与毒理研究

Email:cdutcmlmt@163.com.

彭 成，教授，博士生导师，研究方向为中药药理与毒理研究工作 Email:pengchengchengdu@126.com.

2016-09-26