BKR基因启动子鉴定及表达调控

潘琳，褚春旭，李梓文，孙基丰，张昊

（长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022）

BKR基因启动子鉴定及表达调控

潘琳，褚春旭，李梓文，孙基丰，张昊

（长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022）

BKR基因是睾丸酮丛毛单胞菌中的一个重要的甾体化合物降解酶基因，TetR、LysR和LuxR蛋白是睾丸酮丛毛单胞菌中的调控蛋白。以EGFP为报告基因，构建pK-BKR-EGFP质粒，通过与pK-EGFP分别转化到大肠杆菌JM109，检测荧光信号，确定预测的序列中包含BKR基因的启动子。然后通过质粒共转化技术，检测TetR、LysR和LuxR蛋白与pK-BKR-EGFP的荧光信号强度，探讨TetR、LysR和LuxR三个蛋白与BKR基因之间的调控关系。实验结果表明：BKR基因的启动子在该基因前699bp内；LysR与BKR基因共转后荧光信号增强；TetR和LuxR分别与BKR基因共转后荧光信号减弱。由此可以得出结论，LysR对BKR基因的调控起增强作用；TetR和LuxR对BKR基因的调控起抑制作用。该实验揭示了睾丸酮丛毛单胞菌中BKR基因的调控序列，为CT菌利用甾体激素作为唯一的碳源及能源机理提供理论基础。

启动子；增强绿色荧光蛋白；BKR基因

甾体类化合物对生态环境的污染日趋严峻，引发人和动物的一系列不良的生理反应［1，2］。睾丸酮丛毛单胞菌ATCC11996（Comamonas testosteroni ATCC11996）具有降解多种甾体激素的能力［3］，在降解环境中甾体激素污染上具有很高的应用价值［4］，使人类能够避免一些环境中类固醇激素对人健康的危害。对睾丸酮丛毛单胞菌早期研究发现几个类固醇代谢酶［5，6，7］，对类固醇代谢起关键作用［8］。

BKR基因通过DNA序列分析表明，属于短链脱氢酶（SDR）家族，并参与脂肪酸的合成。先前的研究表明，BKR基因是睾丸酮丛毛单胞菌降解激素所必须的基因［9］。TetR［10］、LysR［11，12］和LuxR［13］基因是菌体中的一种调控基因，可能对BKR基因具有调控作用，但目前尚未有明确的认识。为深入了解TetR、LuxR和LysR基因对BKR基因的调控作用，该实验构建了以增强绿色荧光蛋白（Enforcement green fluorescence protein，EGFP）［14］为报告基因的启动子鉴定质粒，并在此基础上明确了TetR、LuxR和LysR基因对BKR基因的调控作用。以期了解BKR基因的调控基因，进一步了解睾丸酮丛毛单胞菌的调控模型。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒pK-EGFP及睾丸酮丛毛单胞菌由德国基尔大学熊光明教授赠送。质粒Puc19、Puc-TetR、pET 15b、pET-LuxR及pET-LysR为长春理工大学实验室所保存。pUC 18-T，连接酶及PCR反应所以试剂均为Takara公司产品。限制性内切酶 Sal I，BamH I及 buffer为 Thermo公司产品。质粒小量抽提试剂盒及胶回收试剂盒为上海生工产品。JM109菌株为promega公司产品。其他常用试剂为实验室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 带EGFP报告基因的启动子鉴定质粒pKBKR-EGFP的构建

如图1所示，通过PCR及TA克隆构建BKRT质粒，用限制性内切酶Sal I和BamH I对pKEGFP和BKR-T进行双酶切，分别回收大片段和小片段，以T4DNA连接酶连接后获得质粒pKBKR-EGFP。

图1 质粒Pk-BKR-EGFP构建路线图

1.2.2 BKR-T质粒的构建

1.2.2.1 引物设计与合成

根据睾丸酮丛毛单胞菌基因组序列，设计合成一对扩增引物。上游引物为5’-GTCGACCAGCGACCAGCTGCTGCAAAAG-3’，含有Sal I酶切位点；下游引物为5’-GGATCCTGCTGTCTCCTTGGGTGCG-3’，含有 BamH I酶切位点。扩增产物为BKR-699bp片段。引物有吉林省库美生物科技有限公司合成。

1.2.2.2 PCR扩增

反应体系：25μl，2xTaq Maste Mix，上下游引物（10pmol/μl）各 1μl，睾丸酮丛毛单胞菌模版 1μl，ddH2O补足至25μl。反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸50s，循环35次后72℃延伸10min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，观察并成像。

1.2.2.3 质粒构建

PCR产物经胶回收后与pUC 18-T进行连接。连接产物转化到感受态JM109细菌内，接种至LB平板，37℃过夜培养。

1.2.2.4 克隆鉴定

挑取LB平板上生长的单个菌落至LB液体培养基，37℃，180rpm/min震摇培养16h，取1.5ml细菌用质粒小量抽提试剂盒提取质粒，并进行序列分析。DNA序列分析由吉林省库美生物科技有限公司完成。

1.2.3 pK-BKR-EGFP基因的构建

使用Sal I和BamH I将BKR-T和pK-EGFP进行双酶切，用T4DNA连接酶将回收后的片段进行连接，过夜后转化到感受态JM109中并进行克隆鉴定。

1.2.4 BKR基因启动子的荧光检测

将pK-EGFP和pK-BKR-EGFP复苏后，分别取1ml菌液进行离心，13000rpm，1min后，使用生理盐水洗涤2次，13000rpm，1min，用1ml生理盐水将菌体悬起。通过紫外分光光度计在OD600处将pK-EGFP和pK-BKR-EGFP调至相同OD值。后用酶标仪在485nm激发光和530nm发射光处进行荧光检测。

1.2.5 质粒共转化

通过质粒共转化技术将pK-BKR-EGFP质粒 分别与 pUC 19、pUC-TetR、pUC-LuxR 及pUC-LysR质粒进行共转化。其中pUC 19为对照。

1.2.6 荧光检测

将共转化的质粒进行复苏，分别去1ml菌液分别取1ml菌液进行离心，13000rpm，1min后，使用生理盐水洗涤2次，13000rpm，1min，用1ml生理盐水将菌体悬起。通过紫外分光光度计在OD600处将共转化的质粒调至相同OD值。后用酶标仪在485nm激发光和530nm发射光处进行荧光检测。

2 结果与讨论

2.1 BKR-T质粒的构建

2.1.1 BKR基因启动子片段PCR

根据引物的设计，PCR应扩增出699bp的产物，为完整的BKR基因的5’非翻译区。如图2所示，PCR产物位置与设计一致。

图2 BKR基因启动子PCR

孔道M：DNA的标准Marker；孔道1，2：BKR基因PCR的目的片断

2.1.2 BKR-T阳性克隆鉴定

挑取5个克隆做质粒初筛实验，如图3所示，以T载体自连为对照可以看出质粒1，2的条带大小与目的质粒大小相同。送去吉林省库美生物科技有限公司测序出的基因序列，与目的基因序列一致。结果表明已经成功构建BKR-T质粒。

图3 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定BKR-T质粒

孔道T：T载体自连；孔道1，2，3，4，5，6：BKRT目的片断；孔道M1：DNA的标准Marker

2.2 pK-BKR-EGFP质粒的构建

将构建成功的BKR-T质粒通过限制性内切酶Sal I和BamH I将BKR片段酶切下来与通过限制性内切酶Sal I和BamH I酶切的质粒pK-EGFP，连接成功，转化后获得多个阳性克隆，其结果如图4所示，送去吉林省库美生物科技有限公司测序出的基因序列，与目的基因序列一致。结果表明已经成功构建pK-BKR-EGFP。

图4 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定BKR-EGFP质粒

孔道 M1：DNA 的标准 Marker；孔道 pKEGFP：pK-EGFP 质粒；孔道 1，2，3，4，5：BKREGFP目的片断

2.3 BKR基因启动子的荧光检测

将携带有重组质粒pK-BKR-EGFP和pKEGFP的JM109菌株分别涂布于LB固体培养基，37℃，过夜培养。通过紫外分光光度计在OD600处将共转化的质粒调至相同OD值。后用酶标仪在485nm和530nm处进行荧光检测。检测结果如图5所示。由图可以看出含有BKR基因启动子的BKR-EGFP的荧光信号是对照组pK-EGFP的二倍，由此可以得出该5’非翻译区为BKR基因的启动子区域。

图5 BKR基因启动子荧光检测

2.4 TetR、LuxR和LysR对BKR基因调控作用的荧光检测

以pUC 19为对照，分别将pUC 19-TetR，pUC 19-LysR，pUC 19-LuxR与BKR-EGFP进行共转化。将共转化的质粒通过紫外分光光度计在OD600处将共转化的质粒调至相同OD值。后用酶标仪在485nm和530nm处进行荧光检测。检测结果如图6所示，可以看出TetR和LuxR的荧光信号低于对照组，而LysR的荧光信号高于对照组，故得出结论LysR对BKR基因的调控起增强作用；TetR和LuxR对BKR基因的调控起抑制作用。

图6 TetR、LysR、LuxR和BKR基因共转的荧光检测

3 结论

实验通过热击法将重组载体转入至JM109中，成功构建了pK-BKR-EGFP工程菌。通过对目的基因进行荧光检测，检测结果表明该非翻译区确定为启动子区域。在此基础上以pUC 19为对照进行共转化，得到含BKR-pUC 19-EGFP、BKR-pUC19-TetR-EGFP、pK-pUC19-LysREGFP、BKR-pUC 19-LuxR-EGFP 共转 化 菌株。进行荧光检测得到以下结论：LysR对BKR基因的调控起增强作用；TetR和LuxR对BKR基因的调控起抑制作用。

实验通过质粒共转化，荧光检测等生物技术手段，对BKR基因的调控机制进行研究，揭示睾丸酮丛毛单胞菌中BKR基因的调控序列，为睾丸酮丛毛单胞菌利用甾体激素作为唯一的碳源及能源机理提供理论基础，为了进一步分析睾丸酮丛毛单胞菌的调控模型，后续将进行ELISA和EMSA实验对上述结论进行验证，为开发环境中痕量甾体激素的检测试剂提供基础。

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Identification and Expression Regulation of BKR Gene Promoter

PAN Lin，CHU Chunxu，LI Ziwen，SUN Jifeng，ZHANG Hao
（School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）

BKR gene is an important steroid degrading enzyme gene in Comamonas testosteroni.TetR，LysR and LuxR proteins are the regulatory proteins in Comamonas testosteroni.In this experiment，EGFP was used as reporter gene and pK-BKREGFP plasmid was constructed.By converting the pK-EGFP to E.coli JM109，we detected fluorescence signals and determined that our predicted sequence contained the promoter of the BKR gene.Then，the signal intensity of TetR，LysR and LuxR protein and pK-BKR-EGFP was detected by plasmid CO transformation technique，and the relationship between the three proteins of etR，LysR and LuxR and BKR gene was investigated.The results showed that the promoter of BKR gene was enhanced in the pre gene 699bp，and the fluorescence signal was enhanced when LysR and BKR genes were co transferred；the fluorescence signals of TetR and LuxR were decreased when they were co transferred with BKR gene.From this we can conclude that LysR plays an important role in the regulation of BKR gene；TetR and LuxR inhibit the regulation of BKR gene.This experiment has revealed the regulation sequence of BKR gene in the testis，and provided the theoretical basis for the use of steroid hormones as the sole carbon source and energy mechanism for Comamonas testosteroni.

promoter；EGFP；BKR gene

Q789

A

1672-9870（2017）04-0129-04

2017-06-22

潘琳（1996-），女，本科，E-mail：1009670449@qq.com

张昊（1985-），女，博士，讲师，E-mail：853287300@qq.com