ε-聚赖氨酸对关中黑猪精液常温保存效果研究

魏 宁，候震坤，谢景兴，刘兆军，杨公社，庞卫军

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100）

ε-聚赖氨酸对关中黑猪精液常温保存效果研究

魏 宁，候震坤，谢景兴，刘兆军，杨公社，庞卫军*

（西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100）

栏目协办

试验通过对在常温保存的关中黑猪精液中添加ε-聚赖氨酸效果的研究，探究新的减少稀释液中抗生素使用的可能性。向稀释后的精液中分别添加0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 g/L的ε-聚赖氨酸，检测其保存1～5 d的精液质量。结果表明：ε-聚赖氨酸在浓度为0.04～0.64 g/L不会影响精液渗透压，添加ε-聚赖氨酸可以提高关中黑猪精液的保存效果，其中最适浓度为0.16 g/L。

ε-聚赖氨酸；公猪精液；常温保存

由于采精不可能在无菌条件下操作，精液不可避免地会受到来自周围环境如空气、粪便、尿液等中细菌的污染，故能从精液中检测出细菌。相关研究表明，污染精液的细菌主要是革兰氏阴性菌，其中以肠杆菌科菌为主，且精液中细菌的浓度一般为104～105cfu/mL[1]。精液中的细菌会降低精子的品质，影响母猪的繁殖成绩[2]。

目前，主要通过在稀释液中添加抗生素来抑制精液中的细菌生长。然而，由于近年来抗生素在畜牧业中的滥用导致许多抗药性细菌的产生，使得添加在稀释液中的抗生素效果大大降低。一份报告表明，某公猪站中的公猪精液由于受到对庆大霉素具有耐药性的粘质沙雷氏菌污染，精液在常温保存36～48 h后发生大量的凝集，精子的运动能力显著降低[3]。若继续在精液中添加常规抗生素，则可能会使精液中耐药性细菌定向感染母猪。因此，寻找新的抗菌物质完全替代或部分替代传统抗生素是解决这一问题的主要方法之一。

ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种天然的阳离子抗菌肽，ε-PL的特点是对人体无毒无害，结构稳定，在高温下仍然具有抗菌活性，易溶于水[4]，故ε-PL对于环境几乎不会造成任何影响[5]。由于ε-PL具有安全无害，抗菌广谱和可被生物降解等特点。目前该物质已经被广泛用于食品、工业、医疗等领域。在美国和日本，已允许在食品中添加ε-PL。本实验室过去通过体外抑菌试验已知ε-聚赖氨酸拥有一定的抑菌能力，并可以替代一定量的抗生素。本试验在关中黑猪精液中添加不同浓度ε-PL，探究其对关中黑猪精液的影响，为其在关中黑猪精液常温保存的使用提供实践依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 关中黑猪精液精液来源于西北农林科技大学畜牧生产实践基地成年健康关中黑猪公猪。使用BTS液进行稀释，试验组分别添加 0、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28 g/Lε-聚赖氨酸，放入17℃冰箱保存备用。

1.1.2 试剂

异硫氰酸荧光素-花生凝集素（FITC-PNA），罗丹明(Rh123)，碘化丙啶(PI)。

1.1.3 仪器

CASA（计算机精子辅助分析仪），渗透压测定仪，无菌操作台，17℃恒温培养箱，荧光显微镜，37℃恒温水浴锅等。

1.2 方法

1.2.1 精液渗透压的测定

使用渗透压测定仪进行渗透压检测。

1.2.2 不同时间段中精液中菌落数的测定

根据常温保存的时间段，将精液用无菌水稀释至合理的倍数。取100 μL稀释后的精液均匀涂抹于LB固体培养基表面，而后倒置放37℃恒温培养箱中，恒温培养12 h。计数不同稀释倍数下培养皿上的菌落数（每个平板上以30～300个菌落为宜），乘以相应的倍数即为对应精液中细菌的个数。

1.2.3 精子活率的测定

取出关中黑猪精液，将精液轻轻摇匀，取200 μL公猪精液置于1.5 mL的离心管中，放37℃水浴锅中孵育4 min，并将盖玻片和载玻片放37℃恒温载物台上预热。使用精子计算机辅助分析系统（CASA）检测精子活率。分别记下3个视野下精子的活率，取其平均值。

1.2.4 精子质膜完整性的测定

按柠檬酸钠7.35 g/L，果糖13.5 g/L配制柠檬酸钠-果糖低渗液（现配现用），待溶液溶解后，从各试验组中吸取1 mL精液，分别加入9 mL柠檬酸钠—果糖低渗液，在37 ℃条件下水浴30 min，期间不时轻晃试管，以免精子沉积。完毕后，在400倍光学显微镜下观察精子弯尾率。计算在200个精子中尾部弯曲的精子所占比例，记录数据。

1.2.5 精子顶体完整性的测定

使用荧光染料异硫氰酸荧光素-花生凝集素（FITC-PNA）对精子进行染色检测顶体完整率。取30 μL精液均匀涂抹于干净的载玻片上，自然风干。风干后的样品玻片置于无水甲醇中，固定10 min后放置于空气中，自然风干。取30 μL FITC-PNA工作液，均匀覆盖样品，再将玻片置于湿盒内，37℃，避光孵育30min。孵育结束后使用PBS冲洗玻片2～3次，洗去浮色，后迅速在荧光显微镜下观察拍照，使用450～490 nm紫外光激发。选择5个以上清晰的视野，且每个视野精子数200个以上，计算顶体完整精子比例。试验全程避光操作。

1.3 数据处理与分析

使用Microsoft Excel 2016进行统计整理，利用 SPSS 23.0软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），最终以Mean±SD形式表现。P＜0.05表示差异显著，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 ε-PL对稀释液渗透压的影响

由表1可知ε-聚赖氨酸对精液的渗透压影响很小。ε-PL添加量在0.04～0.64 g/L以及0.25 g/L庆大霉素时对于精液的渗透压影响不大（P＞0.05），当该物质添加至1.28 g/L时，精液中的渗透压显著高于其他组（P＜0.05）。

表1 不同浓度ε-聚赖氨酸对精液渗透压的影响

2.2 ε-PL对精液中菌落数的影响

由图1可知，在稀释液中添加0.04～1.28 g/L的ε-聚赖氨酸在常温1～3 d内能有效抑制细菌的生长。当保存至第3天，0.04 g/L与0.16 g/L组内的细菌开始迅速生长，但这两组的菌落数量仍然低于空白对照组，说明在此浓度下ε-聚赖氨酸仍然具有抑菌效果；随着保存时间的增加，ε-聚赖氨酸的抑菌能力降低；而0.64 g/L，1.28 g/L处理组在1～5d内均保持强抑菌效果。

2.3 ε-PL对精子活率的影响

如表2所示常温保存第1天后各处理组与对照组的精子活率差异不明显（P＞0.05)。当保存至第2天时对照组和添加0.08 g/L ε-PL处理组的活率显著高于其他组（P＜0.05）。随着保存时间增加，当保存至第3天时0.04 g/L，0.08 g/L，0.16 g/L ε-PL的处理组显著高于其他组（P＜0.05）。而其他处理组精子的活力均高于对照组。当保存至第4、5天时0.16 g/L ε-PL处理组的保存效果最好。此外，各处理组的精子活力均高于对照组。因此，相比于其他处理组添加0.16 g/L ε-PL常温保存5 d后精子活率最高。

图1 不同浓度ε-聚赖氨酸对精液中菌落数的影响

表2 不同浓度ε-聚赖氨酸对精子活率的影响

2.4 ε-PL对精子质膜完整性影响

如表3所示常温保存两天后，添加0.64 g/L、1.28 g/L ε-PL处理组的质膜完整性显著低于其他组（P＜0.05）。当保存至第3天时，0.16 g/L ε-PL处理组的精子质膜完整性最高。各处理组的质膜完整性高于对照组。而当保存至第5天时，各处理组的质膜完整性均显著高于对照组（P＜0.05)。相对于其他处理组，0.16 g/L ε-PL的处理组质膜完整率最高。

2.5 ε-PL对精子顶体完整性影响

关中黑公猪精液在常温保存第1、2天，公猪精子的顶体完整性差异不显著（P＞0.05）。当保存至第3天时，各处理组中的精子顶体完整性显著高于对照组（P＜0.05），而处理组间添加0.16 g/L ε-PL的处理组精子顶体完整性最高。在第4天时，各处理组的精子顶体完整性仍显著高于对照组，其中0.04g/L、0.08 g/L、0.16 g/L3个处理组精子顶体完整性相近（P＞0.05），且高于其他处理组（P＜0.05）。第 5天时0.16 g/L ε-PL的处理组顶体完整性最高。

表3 不同浓度ε-PL对精子质膜完整性影响

表4 不同浓度ε-PL对精子顶体完整性影响

3 讨论

稀释液的稳定渗透压为保证精子在液态常温保存，而精子的耐受渗透压为240～380 mosm之间，过低的渗透压会影响精子质膜的完整性[6-7]。本试验发现在使用BTS稀释后的关中黑猪精液中添加0.04～0.64 g/L ε-PL后，其渗透压基本不变，说明该物质对于渗透压的影响较小。

ε-PL是一种由赖氨酸残基构成的阳离子抗菌肽，其表面带有大量的正电荷，能黏附到带有大量负电荷的菌体膜上，使菌体膜表面成孔洞状以影响细菌的正常生命活动，从而起到抑菌的作用[8]，其对于G+和G-均具有不错的抑制效果[9]。本试验发现当精液中ε-PL添加量为0.04 g/L时，在0～3 d能有效抑制精液中细菌的生长，但随着保存时间的增加抑制效果逐渐降低。当保存时间在3～5 d时，0.16 g/L处理组精液中细菌含量接近于空白对照组中第2天的细菌数量。因此，在0.16 g/L时就已经能够将公猪精液中的细菌量控制在安全范围内（不损伤精子）。但当精液常温保存超过5 d，添加0.16 g/L ε-PL对精液中细菌控制效果可能会大大降低。

精子活率是评价精子运动能力的重要指标之一，研究发现，当使用精子活率低于60%的精液输精，会降低母猪的繁殖成绩[10]。精子活率是评价常温保存后精子受精能力的重要指标[11]。本试验研究发现当精液常温保存至第2天时，对照组中的精子活率高于其他处理组，一方面可能是因为ε-PL对精子有轻微的毒害作用，另一方面是由于常温保存至第2天精液中存在细菌还不足以影响到精子的运动。

精子质膜和顶体是否完整是精子能否发挥其正常生理功能的保证。2004年曾发现与用传统的精子活率估计母猪繁殖成绩相比，精子质膜和顶体完整性能更准确地评估输精后母猪的繁殖成绩[11]。精子的受精能力不仅与质膜完整性有关还与顶体完整性相关。本试验发现，在常温保存第1天各组间的质膜和顶体完整性差异不显著。当保存至第2天时高浓度ε-PL处理组（0.64 g/L，1.28 g/L），精子质膜完整性显著低于低浓度及对照组。这是由于ε-PL对于精子可能具有轻微的毒性作用。由于公猪精子与其他哺乳动物精子相比，质膜中的胆固醇含量较低，因此，阳离子抗菌肽可能会结合到猪精子膜表面轻微的影响精子质膜和完整性，而公猪精子的顶体几乎未受到影响。总之，精液中的细菌不利于精子的常温保存，其会损伤精子的质膜和提前引发精子的顶体反应。而对照组的质膜和顶体完整性在常温保存第3天后显著低于处理组，是因为细菌在第2天开始大量的繁殖，保存至第3天对照组中的细菌数量已威胁精子存活。当保存至第4、5天时，各处理组的质膜和顶体完整性均高于对照组，而在0.04 g/L处精子仍能够保持较高的顶体完整性，仍可能是由于ε-聚赖氨酸减少了细菌对精子的黏附作用[12]。

4 结论

0.04～0 .64 g/Lε-PL不影响稀释精液的渗透压，但能有效控制精液中细菌的生长，提高关中黑猪精液的保存效果，其中ε-PL的最佳浓度为0.16 g/L。

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2017-08-04）

国家生猪产业技术体系（CARS-36）和西北农林科技大学试验示范站（基地）科技成果推广项目（TGZX2015-18）

魏宁(1993-)，男，在读硕士，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail：wein0513@163.com通讯作者：庞卫军(1972-)，教授，博士生导师，研究方向：肌肉生物学与猪遗传改良，E-mail：pwj1226@nwafu.edu.cn