细菌革兰双重16S rRNA基因荧光定量PCR快速诊断妇产科菌血症

任明保 ，李 扬 ，赵金辉 ，刘 晶 ，王建华

（1.首都医科大学附属北京妇产医院 产一科，北京 100026；2.北京妇产医院 检验科，北京 100026；3.首都儿科研究所 分子研究室，北京 100020）

细菌革兰双重16S rRNA基因荧光定量PCR快速诊断妇产科菌血症

任明保1，李 扬1，赵金辉2，刘 晶2，王建华3

（1.首都医科大学附属北京妇产医院 产一科，北京 100026；2.北京妇产医院 检验科，北京 100026；3.首都儿科研究所 分子研究室，北京 100020）

目的：用已知细菌革兰阴性、阳性菌双重16S rRNA基因荧光定量PCR方法（q-PCR）应用于妇产科患者菌血症的诊断，探讨该方法检测妇产专科患者菌血症的临床应用价值。方法：2013年1月～2014年12月对100例疑为全身感染处于菌血症状态的住院分娩孕产妇进行常规血液培养，同时用细菌革兰阴性、阳性菌双重16S rRNA基因q-PCR方法检测，分析2种方法诊断菌血症的阳性率、敏感性和特异性。结果：通过q-PCR方法检测菌血症阳性率44%，血液培养阳性率16%，两者差异有统计学意义（P＜0.01）；菌血症临床诊断阳性率为37%，与q-PCR法阳性率存在显著性差异（P＜0.01）。以血液培养阳性和（或）临床诊断菌血症的标准作为对照，q-PCR方法诊断敏感性为89.2%，特异性82.5%。结论：细菌革兰阴性、阳性菌双重16S rRNA基因q-PCR方法检测妇产科菌血症的阳性率高于血液培养，可快速为孕产妇患者感染提供早期、敏感的病原学诊断依据。

孕产妇；菌血症；荧光定量聚合酶链反应

感染是妇产科患者围手术和围分娩期常见的并发症，病原菌侵入血液通过血行播散到体内各部位可造成菌血症，全身表现有发热、寒战、乏力等，局部表现有伤口红肿、渗液、化脓等，如不及时治疗可能会危及生命。因此，临床上要求早期快速准确诊断菌血症。常规血培养法是诊断菌血症的金标准，但存在耗时长、诊断慢、花费高、阳性率低、因一次采血量较大患者依从性差、培养结果受主观因素及抗菌药物影响等缺点。随着分子生物学技术的发展，细菌的16S rRNA作为微生物分类依据已得到广泛认同。因此，我们采用已建立的细菌革兰阴性、阳性菌双重16S rRNA基因q-PCR方法，对100例住院分娩疑似感染处于菌血症状态的患者进行检测，旨在探索妇产科菌血症的早期诊断方法和治疗依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

选取北京妇产医院2013年1月～2014年12月100例疑似感染处于菌血症状态的患者，参照最新菌血症诊断指南，分为血液培养阳性的确诊血液感染和临床诊断血液感染，临床诊断血液感染依据2001年国家卫生部 《医院感染诊断标准》中血液感染标准：体温＞38℃或低体温＜36℃，伴有寒战，并合并下列情况之一：有入侵门户或迁徙病灶；有全身中毒症状而无明显感染灶；有皮疹或出血点、肝脾肿大、血液中性粒细胞增多伴核左移，且无其他原因可解释；收缩压＜90mmHg或收缩压下降＞40mmHg。对照组选择40例同期住院的非感染性疾病患者。

1.2 试剂与仪器

血液培养检测采用美国BD公司9240全自动血液培养仪。细菌革兰阴性、阳性菌双重16S rRNA基因q-PCR方法检测采用ABI 7300荧光定量PCR分析仪，PCR引物和探针依据细菌16S rRNA基因保守区域，均由浙江大学医学院儿童医院中心实验室合成。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922及金黄色葡萄球菌ATCC 25923，均购于卫生部临床检验中心。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

无菌条件下，取待检血液标本50μl，加到1.5ml离心管中； 加 50μl DNA 提取液（10mmol/L羟甲基氨基甲烷盐酸盐pH7.6，5mmol/L乙二胺四乙酸，0.5%十二烷基硫酸钠）振荡充分混匀，37℃摇床摇匀30min后置100℃干浴10min，12000rpm离心5min，保留上清备用。

1.3.2 引物与探针

选择细菌16S rRNA基因高保守的区域设计引物，在该引物的片段范围内，通过MegAlign分析软件分别设计针对所有细菌共有的通用探针，对革兰阳性菌特异的革兰阳性探针，对革兰阴性菌特异的革兰阴性探针。引物序列：上游引物（P967F），CAACGCGAAGAACCTTACC （967-985bp）； 下游引物 （P1194R）， ACGTCATCCCCACCTTCC（1194-1177bp）；革兰氏阳性菌探针，FAM-ACGACAACCATGCACCACCTG-TAMRA；革兰氏阴性菌探针，HEX-ACGACAGCCATGCAGCACCT-TAMRA。

1.3.3 q-PCR方法

图1 阳性质控品及阴性对照增长曲线图

抽取上清液2μl作为模板，在ABI 7300检测仪按下列程序进行PCR反应：94℃ 预变性2min后，94℃ 15s、60℃ 60s为一个循环，共循环40次。每次PCR循环均设阳性、阴性对照。阳性对照为大肠埃希菌ATCC25922和金黄色葡萄球菌ATCC25923；阴性对照为注射用水，不加DNA模板。

1.3.4 结果报告

将Baseline曲线初始值设置为7～18，荧光值设置为 4000，使 Correlation 数值介于-1.0～-0.97，FAM通道为革兰阳性菌，HEX通道为革兰阴性菌。 PCR完毕计算循环阈值（cycle threshold，Ct）。如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值≥35的标本，为阴性。若样本的Ct值＜35，则根据不同的革兰阴、阳性不同探针通道判定结果，其中FAM通道为革兰阳性菌，HEX通道为革兰阴性菌。本检测方法的灵敏度和线性范围，根据临床考核结果，灵敏度为 1.0×103copies/ml， 线性范围为 1.0×103～1.0×109copies/ml。

1.3.5 血液培养

血液培养方法参照临床常规血液培养方法。

1.4 统计学方法

采用SPSS20.0软件进行统计学分析，计数资料比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 质量控制

阴性对照：增长曲线不呈S型曲线或Ct值≥35；阳性质控品：增长曲线呈S型，且阳性质控品定量参考 Ct值＜35（图 1）。

2.2 血标本2种检测方法的结果比较

100份标本中基于16S rRNA基因q-PCR方法的检测阳性患者44例，阳性率为44%；血培养阳性16例，阳性率为16%。两者差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 q-PCR方法与临床诊断指标的结果比较

100例病例中，基于临床诊断指标的阳性患者37例，阳性率为37%，显著低于q-PCR的检测阳性率 44%（P＜0.01）。 以血液培养阳性和（或）以临床诊断菌血症作为对照，PCR的诊断敏感性为89.2%（33/37），诊断特异性为 82.5%（52/63）。

3 讨论

妇产科菌血症的感染诊断临床上缺乏特异性的指征，血液培养虽是菌血症诊断的金标准，但其阳性率不高，所需时间长，患者的依从性相对较差。因此，不能达到早期诊断的目的。目前临床诊断菌血症多依靠患者的临床表现和其他指标如体温、血像、CRP、PCT等，但是这些感染指标均存在特异性不足的问题。

随着分子生物学技术的发展，细菌的16S rRNA作为微生物分类依据已得到广泛认同。16S rDNA基因是细菌染色体上编码16S rRNA对应的DNA序列，集保守性和变异性于一身[1，2]，存在于所有细菌的染色体基因组中，在病毒、真菌等非原核生物体内并不存在，其编码基因长度约为1500bp，既能反映不同菌属之间的差异，又能利用测序技术得到其序列，目前几乎所有病原菌的16S rRNA基因测序均已完成，因此，常被选为细菌PCR扩增的目标序列。近年来，国内外开始研究细菌16S rRNA荧光定量PCR方法检测菌血症中的病原菌。浙江大学吴亦栋等的研究 “细菌革兰双检实时荧光定量PCR检测试剂盒”获得专利 （专利号200720192588）。该方法以细菌16SrRNA基因为靶序列，设计通用引物及革兰阴、阳性双特异TaqMan探针，建立了细菌16Sr-RNA基因革兰双检实时荧光定量PCR反应体系。此方法能检测出所有细菌，并能区分革兰氏阳性和阴性菌[3]；而且由于反应在封闭系统，除了具有快速（3h出结果）、敏感性高、特异性高、成本低、采血量少外，还可避免污染。吴亦栋等[3]用该技术对512例新生儿败血症进行了检测，并与血培养方法进行对比。结果发现，细菌检出阳性率，荧光定量PCR方法显著高于血培养方法 （P＜0.01），荧光定量PCR方法阳性率为44%。这种检测方法在妇产科菌血症检测方面的研究还鲜见报道。本研究在前期研究基础上，通过引入革兰阴、阳性双特异TaqMan探针对妇产科疑为菌血症及具有高危因素或临床症状的患者进行实时荧光PCR定量检测细菌16SrDNA序列，同时与血培养仪连续监测法比较，对荧光定量PCR法的敏感性和特异性进行研究，旨在探索妇产专科患者菌血症病原菌的快速、准确的检测方法[4，5]。

相关报道显示，应用荧光定量PCR检测16S rRNA基因对早期菌血症或疑似血源性感染的患者，可提供快速准确的治疗依据[6，7]。本研究结果发现，若以血液培养阳性和（或）以临床诊断血液感染作为对照，q-PCR方法的诊断敏感性为89.2%，诊断特异性为82.5%，说明基于16S rRNA基因的q-PCR方法是一种有很大潜力和价值的诊断方法。同时，通过分别合成革兰阳性探针和革兰阴性探针，可以进一步判断血液感染的病原菌为革兰阳性球菌或革兰阴性杆菌，为临床医师有针对性的选择抗菌药物抗感染治疗提供帮助。此外，该方法检测快速，从采集标本到PCR扩增只需4～6h即可完成，而通常血液培养至少需要3～5d，显著提高了工作效率。

本试验的数据显示，q-PCR方法的阳性率为44%，远高于血液培养的阳性率16%，亦高于临床诊断指标37%，说明q-PCR方法能够发现其他方法无法查到的细菌感染。100例患者中，16例为血液培养阳性确诊的菌血症，37例临床诊断的菌血症，共计诊断菌血症为37例。其中q-PCR方法检测阳性33例，11例检测假阳性的原因在于临床诊断指标特异性较低，此外，在q-PCR方法操作过程中也有发生污染的可能。分析q-PCR方法检测与常规血液感染诊断不符合的原因，可能由于q-PCR体系中血红蛋白等抑制物存在较多或抽提过程中细菌DNA的丢失而导致q-PCR方法假阴性[8，9]，以及存在某些特殊培养条件的细菌如L型细菌等或某些无法培养的细菌[10]。由于本试验只涉及细菌引起的血液感染，对真菌、病毒、支原体属、衣原体属等其他病原体引起的血液感染尚不能提供诊断帮助。

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Rapid diagnosis of bacterimia in gynecological and obstetric patients with FQ-PCR as coding 16S rRNA gene

REN Ming-bao，LI Yang，ZHAO Jin-hui，et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2017 Aug，31（4）：218-221

Objective：To develope a fluorescence quantitative polymerase chain reaction （FQ-PCR）method based on 16S rRNA genes for the diagnosis of infections in gynecological and obstetric patient in order to improve the efficiency and accuracy of bacterial detection.Methods：One hundred patients suspected with bacterimia were cultured and bacterial 16S rRNA gene were detected synchronously by extraction of DNA，primer and probe design，PCR amplification and fluorescent quantitative detection of amplified products.The positive rate，sensitivity and specificity of these two methods were compared.Results：The positive rate was 44% by FQ-PCR，which was significantly higher than 16%by blood culture （P＜0.01）.Taking the criteria of positive blood culture and/or clinical diagnosis of bacterimia as control，the sensitivity was 89.2%and the specificity was 82.5%for FQ-PCR.Conclusion：The positive rate of FQ-PCR was significantly higher than that of blood culture and could be an early and sensitive method for pathogenic diagnosis of bacterimia in gynecological and obstetric patients.

pregnant woman；bacterimia；fluorescence quantitative polymerase chain reaction

R714

A

1001-0025（2017）04-0218-04

doi∶10.3969/j.issn.1001-0025.2017.04.005

Authors addressDepartment of Obstetric，Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital，Capital Medical University，Beijing 100026，China

任明保（1970-），男，副主任医师，医学博士。

2016-12-15

2017-03-02