新会柑胎仔与青皮、陈皮的黄酮含量分析与比较

盛钊君，葛思媛，张焜，谭永权，刘泽璇，李裕琳，谢芳英，陈小乐（五邑大学化学与环境工程学院，广东江门529020）

新会柑胎仔与青皮、陈皮的黄酮含量分析与比较

盛钊君，葛思媛，张焜，谭永权，刘泽璇，李裕琳，谢芳英，陈小乐（五邑大学化学与环境工程学院，广东江门529020）

采用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）与分光光度法两种检测手段，分析和比较了新会柑胎仔、1年青皮、5年陈皮、10年陈皮4种样品的黄酮苷类和多甲氧基黄酮类化合物的含量。HPLC检测结果表明，新会柑胎仔的橙皮苷含量高达12.8%，远远高于其他3种样品。同时，新会柑胎仔的橘皮素（0.3%）和川陈皮素含量（0.6%）也略高于其他3种样品。分光光度法的检测结果显示，4种样品中黄酮苷类成分含量由高到低分别是柑胎仔（9.5%），10年陈皮（6.1%），5年陈皮（5.2%），1年青皮（4.9%）；多甲氧基黄酮类成分含量由高到低分别是柑胎仔（2.5%），1年青皮（1.9%），5年陈皮（1.7%），10年陈皮（1.6%）。两种检测结果均表明柑胎仔中黄酮含量远远高于青皮或陈皮，在功能食品的研究和开发中具有应用潜力。

柑胎仔；陈皮；高效液相色谱（HPLC）；黄酮；橙皮苷

Abstract：The contents of flavone glycosides and polymethoxylated flavones in Xinhui tangerine buds，1-yearold mandarin orange peel，5-years-old Chenpi and 10-years-old chenpi were determined and compared by HPLC and spectrophotometry.The results of HPLC showed that the Content of hesperidin in tangerine buds reached up to 12.8%，which was much higher than the other three samples.Moreover，the contents of tangeritin（0.3%）and nobiletin（0.6%）in Xinhui tangerine buds were also slightly higher than the other three samples.The results of spectrophotometry showed that the contents of flavone glycosides in the four samples from high to low were tangerine buds（9.5%），10-years-old Chenpi（6.1%），5-years-old Chenpi（5.2%），1-year-old mandarin orange peel（4.9%），and the contents of polymethoxylated flavones from high to low were tangerine buds（2.5%），1-year-old mandarin orange peel（1.9%），5-years-old Chenpi（1.7%），10-years-old Chenpi（1.6%）.The results of both methods showed that the content of flavonoids in tangerine buds was much higher than mandarin orange peel and Chenpi.Xinhui tangerine buds have great potency in the development and research of functional foods.

Key words：tangerine buds；Chenpi；high performance liquid chromatography（HPLC）；flavonoids；hesperidin

新会柑，又称陈皮柑，广东省江门市著名土特产，中国地理标志产品。将新会柑皮晒干可以得到青皮，将青皮陈化3年以上便是我们所熟知的“新会陈皮”。新会陈皮是广东省十大传统地道药材之一，兼具药食两用的特色，主治脘腹胀满、食少吐泻、咳嗽多痰。近几十年来，大量文献报道了有关陈皮的功能成分及功效的研究[1-3]。研究结果表明，新会陈皮具有抗氧化、抗癌、抑菌等多种生理功效[4-6]，而主要功效成分为挥发油和黄酮类成分[1，7]。陈皮中主要含两种黄酮类成分：一种是柚皮苷（naringin，图 1）、橙皮苷（hesperidin，图1）等二氢黄酮苷类；一种是橘皮素（tangeritin，图1）、川陈皮素（nobiletin，图1）等多甲氧基黄酮类[8-9]。《中国药典》2015年版以橙皮苷作为指标性成分评价陈皮的质量。橙皮苷是一个生物活性确切、药理作用广泛的黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、调节免疫力、防辐射、保护心血管系统等多种药理活性，在医药学上有广泛的用途和利用前景[10-12]。

图1 柚皮苷、橘皮素、橙皮苷、川陈皮素的化学结构Fig.1 Chemical structure of naringin，tangeritin，hesperidin and nobiletin

新会柑胎仔，又名青柑仔、柑仔乳果，是新会柑树开始生长果子的时候摘取下来的胎果，其大小与桂圆差不多（图2）。将胎果清洗消毒，晒干保存一段时间，胎果的颜色逐渐变深，便制成了新会柑胎仔。新会柑胎仔一般用来泡茶或者煲汤，口感和香味不逊色于陈皮，近年来越来越受到广东本地人们的喜爱。然而，尽管针对新会陈皮的研究报道众多，但未见任何新会柑胎仔的研究报道。本研究采用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC） 和分光光度法两种检测手段，首次分析和对比了新会柑胎仔、1年青皮、5年陈皮及10年陈皮4种样品的4种黄酮类成分含量，为新会柑胎仔应用于功能食品的研究和开发中提供依据和参考。

图2 新会柑胎仔Fig.2 Xinhui tangerine buds

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新会柑胎仔、5年陈皮、10年陈皮：广东省江门市新会区天马村，由新会陈皮协会提供。1年青皮：广东省江门市新会区梅江村，由江门市新会区新宝堂陈皮有限公司提供。

橙皮苷标准品（批次号为H1319078）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；柚皮苷、川陈皮素、橘皮素标准品（批次号分别为 K21F3C1、P10A6F2261、H09M7K14409）：上海源叶生物科技有限公司。色谱分析和分光光度分析所用溶剂均为色谱纯级别。其他未说明试剂均为分析纯级别。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（LC-20A）：岛津仪器；紫外可见分光光度计（UV-8000S）：上海元析仪器有限公司；超声波仪（KQ-600KDE）：昆山市超声仪器有限公司；离心机（TD5A-WS）：长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品提取方法

分别将柑胎仔、1年青皮、5年陈皮及10年陈皮烘干，粉碎，过80目筛，用密封袋封好样品粉末保存备用。各取粉末250 mg，加入25 mL甲醇，超声提取30 min，过滤，离心，即得10 mg/mL样品溶液。

1.3.2 液相色谱分析方法

1.3.2.1 色谱条件

色谱柱：WelchromⓇC18，150 mm×4.6 mm×5 μm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：283 nm；流动相：A为0.5%醋酸水溶液，B为乙腈，采用梯度洗脱（方法参数如表1所示）；流速为1.0 mL/min。

表1 梯度方法参数Table 1 Gradient method parameters

1.3.2.2 4种黄酮标准曲线的绘制

称取4种标准品柚皮苷5.4 mg、橙皮苷5.2 mg、橘皮素3.2 mg、川陈皮素3.9 mg，混合溶于10 mL甲醇中，得到储备液，然后再稀释为6个浓度梯度，分别为柚皮苷 0.010 8 mg/mL～0.54 mg/mL，橙皮苷 0.010 4 mg/mL～0.52 mg/mL，橘皮素 0.006 4 mg/mL～0.32 mg/mL，川陈皮素0.007 8 mg/mL～0.39 mg/mL。以标准品浓度（单位mg/mL）为横坐标，上述色谱条件下所得的峰面积为纵坐标进行回归计算，得出回归方程和相关系数。

1.3.3 分光光度分析方法

1.3.3.1 检测波长的确定

陈皮中的黄酮类化合物主要分为两大类：黄酮苷类和多甲氧基黄酮类。经过对4种黄酮成分进行全波长扫描，同一类黄酮成分的最大吸收波长相近。因此，选取橙皮苷作为黄酮苷类代表，在橙皮苷的最大吸收波长283 nm下，测定黄酮苷类成分的含量。选取橘皮素为多甲氧基黄酮类代表，在橘皮素的最大吸收波长328 nm下，测定多甲氧基黄酮类成分的含量。

1.3.3.2 橙皮苷标准曲线的绘制

称取橙皮苷标准品5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀制成0.20 mg/mL储备液。将储备液稀释，配得浓度分别为 0、2.0、5.0、8.0、11、14、17 μg/mL的待测溶液。在283 nm波长处测定吸光度，每个浓度样品平行测定3次，取平均值。以橙皮苷浓度C（μg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.3.3 橘皮素标准曲线的绘制

步骤同 1.3.3.2，橘皮素标准溶液为 0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 μg/mL，检测波长为 328 nm。

1.3.3.4 测定样品待测溶液中黄酮含量

为了提高测定的准确度，将10 mg/mL样品储存溶液分别稀释至3种浓度的待测溶液：0.1、0.2、0.3 mg/mL。每一个待测溶液平行测定3次，取平均值吸光度。根据标准曲线所得的回归方程，计算出两类黄酮含量的百分比。

2 结果与分析

2.1 HPLC分析

2.1.1 4种黄酮标准品的分离

考察了甲醇-醋酸水溶液，乙腈-醋酸水溶液两种体系流动相，以及流动相中不同比例对样品分离的影响，结果见图3。

图3 4种黄酮标准品混合物色谱图Fig.3 The chromatogram of the mixture of four reference standards

结果表明，采用乙腈-0.5%醋酸水溶液体系作为流动相时，4种黄酮苷类成分有较好的分离。采用梯度洗脱较等度洗脱，能明显改善各特征峰的分离效果，既能满足基线分离的要求，又有适宜的保留时间。最终，在1.3.2.1所述的色谱条件下，4种黄酮化合物的峰能完全分离。经分别对4种标准品分析可知，保留时间为 20.8、21.6、34.4、36.1 min的物质分别是柚皮苷（标准品1#）、橙皮苷（标准品2#）、川陈皮素（标准品4#）、橘皮素（标准品 3#）。

2.1.2 橙皮苷、橘皮素及川陈皮素的标准曲线绘制

所检测的4种黄酮标准品均微溶于甲醇，经对其溶解度进行测试，确定标准溶液所能达到最大浓度约为0.5 mg/mL。因此，在此浓度水平下，对标准品溶液进行梯度稀释。由于在样品检测中，4种测试样品中均未检测到柚皮苷，由此只绘制橙皮苷、橘皮素及川陈皮素3条黄酮标准曲线，结果见图4。

图4 橙皮苷、橘皮素及川陈皮素的HPLC标准曲线Fig.4 HPLC standard curves of hesperidin，tangeritin and nobiletin

如图4所示，在检测浓度范围内，3种黄酮浓度与各自的峰面积均成线性。橙皮苷的回归方程为y=16 670 084x-17 826（R2=0.999 8），橘皮素的回归方程为 y=27 725 247x-17 950（R2=0.999 8），川陈皮素的回归方程为 y=19 163 512x-11 088（R2=0.999 8）。

2.1.3 样品的液相色谱分析

在同样的色谱条件下，相同浓度的柑胎仔（样品1）、1年青皮（样品 2）、5年陈皮（样品 3）及 10年陈皮（样品4）的样品溶液分析结果如图5所示。

图5 4种样品液相色谱图Fig.5 Liquid chromatography spectra of 4 samples

由图5可知，4种样品中的黄酮成分均以橙皮苷为主，其次是橘皮素和川陈皮素，而柚皮苷含量很低，几乎检测不到。将各个峰面积代入标准品的回归方程中，可求得样品溶液中各种黄酮的浓度。然后，根据样品溶液浓度为10 mg/mL，计算出样品中各种黄酮成分所占的质量百分比。检测结果如表2所示。

表2 HPLC检测黄酮含量结果Table 2 Results of flavonoids content determination by HPLC

由表2可知，4种样品中的橙皮苷含量均达到《中国药典》标准（不得少于2.5%），尤其是柑胎仔的橙皮苷含量远远大于其他3种样品，高达12.8%。此外，新会柑胎仔的橘皮素和川陈皮素的含量分别为0.3%、0.6%，也略高于其他3种样品。其他3种样品总体相比较，10年新会陈皮黄酮含量较高，1年新会陈皮次之，5年新会陈皮最低。

2.2 分光光度分析

2.2.1 标准曲线的绘制

橙皮苷和橘皮素的分光光度标准曲线见图6。

图6 橙皮苷和橘皮素的分光光度标准曲线Fig.6 Spectrophotometric standard curves of hesperidin and tangeritin

如图6所示，橙皮苷在2.0 μg/mL至17 μg/mL的浓度范围内，浓度与吸光度呈现良好的线性关系，回归方程为y=0.034 7x+0.003 3（R2=0.999 9）。橘皮素在4.0 μg/mL至9.0 μg/mL的浓度范围内，浓度与吸光度呈现良好的线性关系，回归方程为y=0.074 4x-0.005 8（R2=0.999 0）。

2.2.2 样品黄酮含量的测定

为了增加检测的准确性，将每一种样品配制3个浓度（0.1、0.2、0.3 mg/mL）的待测溶液，分别在 283 nm和328 nm处测吸光度，平行测定3次，取吸光度平均值，由标准曲线分别算出两类黄酮成分的浓度。然后，根据待测溶液的浓度，将黄酮浓度换算成黄酮占样品粉末重量的百分比，3个浓度所得结果取平均值，其结果如表3所示。

表3 分光光度检测黄酮含量结果Table 3 Results of flavonoids content determination by spectrophotometry

结果表明，采用分光光度的方法，其结果与HPLC检测大致一致。对黄酮苷类成分而言，柑胎仔中的含量约为其他3种样品的2倍，青皮和陈皮相比较，10年陈皮的黄酮苷类成分较高，占陈皮质量的6.1%，这也一定程度上验证了陈皮“陈久者良”一说。对多甲氧基黄酮类成分而言，4种样品的差别不大，但是柑胎仔中多甲氧基黄酮类的含量仍然明显高于其他样品，占柑胎仔质量的2.5%。

分光光度法的检测结果与HPLC结果相比较，趋势大致一致，但也略微有所不同。对于单一成分的定量检测，HPLC检测的结果更准确。但是，柑橘属植物中的黄酮成分较复杂，已经报道就多达60多种[7]。因此，采用分光光度检测，更适用于检测某一大类黄酮成分的含量。

3 结论

本研究采用HPLC和分光光度两种检测手段，分析和比较了新会柑胎仔、1年青皮、5年陈皮、10年陈皮中橙皮苷、橘皮素以及川陈皮素等黄酮成分含量。两种分析检测结果均表明，新会柑胎仔中的黄酮含量远远高于其他3种样品。HPLC定量分析检测结果表明，新会柑胎仔中的橙皮苷含量极高，高达12.8%，是其他样品的3倍～5倍。新会柑胎仔中的橘皮素和川陈皮素成分的质量分数分别为0.3%和0.6%，亦明显高于青皮和陈皮。分光光度分析结果表明，新会柑胎仔中的黄酮苷类成分约为青皮或陈皮的2倍，多甲氧基黄酮类成分同样明显高于其他样品，两种检测结果基本相符。目前，新会柑胎仔醇提物的生物活性测试正在本实验室中进行，其功能成分对其生物活性产生的影响亦在研究中。总之，本研究结果表明，新会柑胎仔这一广东地区特色农产品具有较大的研究价值和较好的应用开发前景，本研究为新会柑胎仔的研究填补了空白，为广陈皮行业的发展提供一条新思路，也为新会柑胎仔应用于功能食品的研究与开发中提供了研究基础和试验依据。

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Quantitative Determination and Comparison of Flavonoids of Xinhui Tangerine Buds，Mandarin Orange Peel and Chenpi

SHENG Zhao-jun，GE Si-yuan，ZHANG Kun，TAN Yong-quan，LIU Ze-xuan，LI Yu-lin，XIE Fang-ying，CHEN Xiao-le
（School of Chemical and Environmental Engineering，Wuyi University，Jiangmen 529020，Guangdong，China）

2017-03-16

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.028

广东省自然科学基金项目（2016A030310441）；五邑大学博士启动基金（2016BS18）；五邑大学青年科研基金（2015zk03，2016td01）

盛钊君（1987—），女（土家），讲师，博士，研究方向：天然资源的综合利用及药物开发。