响应面优化生姜多糖提取工艺及其抗氧化活性研究

赵文竹，王欣珂，于志鹏，*，张瑞雪，李思慧，刘静波，励建荣

（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁锦州121013；2.吉林大学营养与功能食品研究室，吉林长春130062）

响应面优化生姜多糖提取工艺及其抗氧化活性研究

赵文竹1，王欣珂1，于志鹏1，*，张瑞雪1，李思慧1，刘静波2，励建荣1

（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁锦州121013；2.吉林大学营养与功能食品研究室，吉林长春130062）

采用Box-Benhnken法优化生姜多糖的提取工艺参数，分别考察提取时间、提取温度及液固比对多糖得率的影响，采用三因素三水平响应面法进行多糖提取工艺的优化，利用傅立叶红外光谱分析其结构。结果表明，生姜多糖最佳提取时间为2 h 44 min，提取温度为71.6℃，液固比为41∶1（mL/g），在此条件下，生姜多糖得率为3.13%。后经抗氧化活性测定，生姜多糖提取物具有一定抗氧化活性。

生姜多糖；提取；纯化；抗氧化活性

Abstract：The extraction of polysaccharides from ginger was optimizition by Bom-Benhnken desing，a multiple quadratic regression describing the relationship between the parameters such as extraction time，extraction temperature，liquid-to-material ratio were established using a 3-factor，3-lever Box-Behnkon design，and the structure of polysaccharides was analysised by FTIR.The results showed，the optimal extraction condition was obtained as extraction time 2 h 44 min ，extraction temperature71.6 ℃，liquid-to-material ratio 41∶1（mL/g）.Under such conditon the yield of polysaccharides from ginger was 3.13%.From some experimengts，we find ginger polysaccharides have antioxidant activity.

Key words：ginger polysaccharides；extraction；purificaiton；antioxidant activity

多糖类化合物具有多重生理功效，如抗氧化、驱寒、止呕、健胃解毒、延缓衰老、降低胆固醇、抗癌、抑菌、免疫调节、抗炎、抗辐射等。龚涛等[1]研究了枸杞多糖的抗氧化和抗肿瘤功能，研究表明枸杞多糖能提高血清SOD酶的活力，Kodama等[2]研究了灰树花多糖的抗肿瘤的作用，研究结果表明，多糖对抑制干扰素-γ、肿瘤致死因子-α的水平均有提高，该多糖对肿瘤细胞有抑制作用，Nair等[3]研究表明茜草中提取的一种多糖（RRl）具有免疫调节作用。

生姜，属于姜科姜属，多年生宿根草本植物，是最常用的香辛料之一。生姜中含有丰富的营养物质，如姜黄酮、姜辣素、姜糖蛋白、姜精油和姜多糖[4]，生姜多糖具有一定的抗氧化活性[5]，但生姜多糖的纯化及红外结构研究相对较少。本研究以生姜为原材料，对生姜多糖提取工艺及其还原力活性进行研究，同时对生姜多糖的红外结构进行初探，旨在为生姜多糖活性的提取、纯化及结构研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生姜：锦州市兴隆大家庭超市；苯酚、抗坏血酸、铁氰化钾：天津虔诚伟业科技发展有限公司；浓硫酸：锦州古城化学试剂厂；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠：天津市风船化学试剂科技有限公司；氯化铁：天津永晟精细化工有限公司；氯化亚铁：天津博迪化工股份有限公司；三氯乙酸：天津市福晨化学试剂厂；以上药品均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-5100紫外-可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；数显恒温水浴锅：金坛市鑫鑫实验仪器厂；电热鼓风干燥箱：上海—恒科学仪器有限公司；FA1204B电子天平：上海天美天平仪器有限公司；KF20002电子天平：浙江凯丰集团有限公司；TG16KR台式高速冷冻离心机：长沙东旺实验仪器有限公司；SCIENTZ-10N冷冻干燥机：宁波新芝生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 热水浸提法提取生姜多糖

将鲜生姜切片60℃烘干24 h，粉碎后过60目筛，制得生姜粉。准确称取一定量的生姜粉末样品，放入圆底烧瓶中，加入适量的蒸馏水进行热水浸提，按照试验设定的提取时间、提取温度和液固比进行热水浸提，静置冷却至室温，抽滤，得到生姜多糖提取液。

1.3.2 生姜多糖提取的单因素试验

1.3.2.1 提取时间对生姜多糖得率的影响

取预处理的姜粉 2 g，以液固比为 30∶1（mL/g），水浴温度为 70 ℃，提取时间分别为 1.5、2、2.5、3、3.5、4 h，利用热水浸提法进行提取。测定多糖得率，比较选取最佳提取时间。

1.3.2.2 提取温度对生姜多糖得率的影响

取预处理的姜粉 2 g，以液固比为 30∶1（mL/g），提取时间为 3 h，水浴温度分别为 30、40、50、60、70、80、90℃，利用热水浸提法进行提取。测定多糖得率，比较选取最佳提取温度。

1.3.2.3 液固比对生姜多糖得率的影响

取预处理的姜粉2 g，以水浴温度为70℃，提取时间 3 h，液固比分别为 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）利用热水浸提法进行提取。测定多糖得率，比较选取最佳液固比。

1.3.3 响应面优化设计及数据分析方法[7]

响应面法以最经济的方式、较少的试验次数和较短的时间对3种试验因素进行全面研究[6-7]。根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，将影响生姜多糖得率（Y）的3个主要影响因素：提取时间（X1）、提取温度（X2）、液固比（X3）进行组合。以-1、0、1 代表自变量水平，按方程xi=（Xi-X0）/ΔX对自变量进行编码。式中：xi为自变量的编码值；Xi为自变量的真实值；X0为试验中心点处自变量的真实值；ΔX为自变量的变化步长。试验因素及水平编码如表1所示。

表1 因素编码表Table 1 Experiment factors coding table

根据因素和水平共安排设计17次试验，试验号1～12是析因试验，试验号13～17是中心试验。17个试验点分为析因和零点，其中析因点和零点分别为自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点和区域的中心点，零点试验重复5次，用以估计试验误差。采用Design-Expert8.0软件对试验数据进行回归分析。

1.3.4 生姜多糖含量的测定

多糖测定采用苯酚-硫酸法[8]。将生姜多糖提取液，稀释适当的倍数（N，稀释倍数需要预试验，使其在490 nm处测定吸光度值在0.2～0.8范围内）。依次吸取1 mL的样品稀释液、0.5 mL的苯酚、2.5 mL的浓硫酸依次加入试管中，沸水浴加热15 min，静置到室温，在490 nm处测定其吸光度值（A490nm），由葡萄糖标准曲线得到的回归方程：y=（x+0.023）/0.01吸光度值为横坐标（x）、多糖的质量浓度（mg/mL）为纵坐标（y）。由回归方程计算出以葡萄糖计的稀释后生姜提取液中多糖的质量浓度（y），计算出稀释前生姜提取液中多糖的质量浓度（C=y×N）

式中：Y为生姜多糖得率，%；C为生姜提取液中多糖的质量浓度，mg/mL；V为提取液体体积，mL；W为原料质量，g。

1.3.5 生姜多糖抗氧化活性研究

生姜多糖DPPH清除率的测定、还原力测定、金属熬合能力测定的测定按照参考文献[4]的活性测定完成。

2 结果与分析

2.1 多糖提取单因素试验结果分析

不同因素对多糖得率的影响见图1。

图1 不同因素对多糖得率的影响Fig.1 Effect of different factors on the yield of polysaccharides

由图1（a）可以看出在2.5 h之前多糖得率明显增加，说明随着提取时间的增加，提取液中多糖浓度明显增加。在2.5 h之后上下浮动，但总体平缓上升，3.5 h到达峰值后下降。说明在2.5 h到3.5 h期间大部分多糖包括果胶、黏液质已溶出达到平衡，故多糖得率提高减慢，故不需要过长提取时间，因此提取时间选用2.5 h。由图1（b）由图可以看出随温度上升多糖得率逐渐增加，并在70℃达到峰值，70℃之后多糖得率趋于平缓并有所下降，说明温度过高会使多糖降解，故多糖得率降低，故不需要过高提取温度，因此提取温度选用70℃。由图1（c）可以看出液固比在40∶1（mL/g）之前多糖得率趋势明显增加，说明随着液固比的增加，提取液中多糖浓度明显呈增加的趋势。在40∶1（mL/g）之后得率下降。说明水对多糖有一定的溶解度，一定量的水只能溶解一定的糖，但水分太大在一定加热时间里，温度升高速度减慢，多糖未充分溶于水中。故不需要过大液固比，因此液固比选用40∶1（mL/g）。综上所述，最优条件为提取时间2.5 h、提取温度70℃、液固比 40∶1（mL/g）。

2.2 响应面试验结果分析

2.2.1 试验设计

响应面优化试验设计及结果见表2，方差分析表见表3。

表2 响应面优化试验设计及结果Table 2 Experimental design and results of optimizing test by response surface method

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis

续表3 方差分析表Continue table 3 Variance analysis

生姜多糖得率结果见表2，采用SAS RSREG程序对所得数据进行回归分析[6]，3个因素经过拟合得到多糖得率（Y）回归方程：

由表3可知，模型的P值小于0.05，表明二次方程拟合显著，而且失拟项的P值大于0.05，表明失拟项不显著，说明该模拟方程可行性较好，这种试验方法是可靠的，即使用该方程模拟真实的三因素三水平分析是可行的。其中决定系数R2值为0.88，校正系数R2Adj值为0.73，则说明通过二次回归得到的多糖得率的模型与试验拟合较好。又因其变异系数CV值越低，显示试验稳定性越好。由表3中SAS RSREG回归分析可知，方程中X1对Y值影响极显著，表明提取时间对多糖得率影响较大，X1X1，X2X2，X3X3对Y值影响均显著，表明试验因子对响应值不是简单地线性关系。综上所述，该回归方程为优化热水浸提生姜多糖的工艺条件提供了一个良好的模型，可以利用该回归方程确定最佳工艺条件。

对于生姜多糖得率模型，回归方程的方差分析结果表明，方程中的3个因素的线性平方和项的影响为显著（P＜0.05）（表3）。同时，由F值的大小可以推断，在所选择的试验范围内，3个因素对多糖得率影响的排序为提取时间（X1）＞提取温度（X2）＞液料比（X3）。

2.2.2 影响生姜多糖得率的主要因素分析[7]

将建立的回归模型中的任一因素固定在最优水平，得到另外2个因素的交互影响结果，二次回归方程的响应面及其等高线如图2～图3所示。

图2 交互作用对生姜多糖得率影响的响应面图Fig.2 Three-dimensional response surface plot showing the interactive effects on the yield of ginger polysaccharides

由图 2～图 3 所示，图 3（a）为 X1X2交互等高线，可以看出提取时间轴向等高线变化密集，而温度轴向等高线变化相对稀疏，说明提取时间对生姜多糖得率的影响比时间大；由图2（a）得率先随X1的升高而上升，达到一定值后开始下降，可能与加热时间过长易使多糖分解有关。如图3（b）在X1X3交互等高线中，提取时间轴向等高线变化密集，而液固比轴向等高线变化相对稀疏，说明提取时间对响应值峰值的影响比液固比大；由图2（b）可以看出得率先随X1的升高而上升，达到一定值后开始下降，可能与加热时间过长易使多糖分解有关。如图3（c）在X2与X3交互作用等高线中，等高线密度在2个方向相差不大，沿X2轴方向略大于X3轴方向，说明提取温度和液固比的交互作用中，提取温度对响应值峰值的影响略大于液固比。

用“规划求解”对方程进行求解，得最佳条件为：提取时间2 h 44 min、提取温度71.60℃、液固比41∶1（mL/g），最佳生姜得率为3.10%。

图3 交互作用对多糖得率影响的等高线图Fig.3 Three-dimensional response surface plot showing the interactive effects on the yield of ginger polysaccharides

2.3 验证试验

根据响应面法得出的最优工艺参数，即提取时间2 h 44 min、提取温度 71.60 ℃、液料比 41∶1（mL/g）的工艺条件提取生姜多糖。测定生姜多糖得率，以验证响应面法的可行性。试验结果显示多糖得率的实测值3.13%，预测值3.10%。预测值与实测值非常接近，偏差较小，说明由响应面法所得到的优化区域符合设计目标，试验设计和数学模型具有可靠性和重现性。可见采用响应面法可实现优化生姜的提取工艺的目标，得到具有实际应用价值的多糖提取工艺流程。

2.4 抗氧化活性研究

分别测定生姜多糖对DPPH自由基的清除率、还原力和Fe2+的清除率如图4所示。

图4 生姜多糖的抗氧化活性Fig.4 The antioxidant activity of polysaccharides from ginger

多糖的还原力和清除率都呈明显的上升趋势，生姜多糖具有一定清除DPPH自由基的能力，而且随着多糖浓度的增大而增高，维生素C和生姜多糖的IC50值分别为4.8 μg/mL和0.42 mg/mL，生姜多糖对DPPH自由基的清除能力相当于维生素C的1.14%，生姜多糖具有一定的还原力，但还原力作用效果不大，相当于维生素C的0.5%。生姜多糖具有一定清除Fe2+的能力，而且随着多糖浓度的增大而增高，维生素C和生姜多糖的IC50值分别为4.21 μg/mL和2.18 mg/mL。

3 结论

通过Box-Benhnken的中心组合设计响应面法建立了提取时间、提取温度、液固比与多糖得率的数学模型，采响应面优化法实现了多糖提取的多指标优化，得出生姜多糖得率较高的最佳提取工艺参数为提取时间2 h 44 min、提取温度71.6℃、液固比41∶1（mL/g），生姜多糖得率达到3.13%。生姜多糖DPPH自由基清除能力的IC50值为0.42 mg/mL，还原力相当于维生素C的0.5%，金属螯合能力的IC50值为4.18 mg/mL。

[1]龚涛,王晓辉,赵靓,等.枸杞多糖抗氧化作用的研究[J].生物技术,2010,20(1):84-86

[2]Noriko K,Kiyoshi K,Norio S,et al.Effects of D-Fraction,a Polysaccharide from Grifola frondosa on Tumor Growt Involve Activation of NK Cells[J].Journal of Pharmacobio-Dynamics,2002,25(12):1647-1650

[3]Nair P K R,Sonia R,Reshma R,et al.Immune stimulating properties of a novel polysaccharide from the medicinal plant Tinospora cordifolia[J].International Immunopharmacology,2004,4(13):1645-1659

[4]赵文竹,张瑞雪,于志鹏,等.生姜的化学成分及生物活性研究进展[J].食品工业科技,2016,37(11):383-389

[5]Zhongshan Zhang,Xiaomei Wang,Jingjing Zhang,et al.Potential antioxidant activities in vitro of polysaccharides extracted from ginger(Zingiber officinale)[J].Carbohydrate Polymers:Scientific and Technological Aspects of Industrially Important Polysaccharides,2011,86(2):448-452

[6]Ping Y,Chao X.Statistics-based optimization of the extraction process of kelp polysaccharide and its activities.[J].Carbohydrate Polymers,2013,91(1):356-362

[7]王明艳,鲁加峰,王晓顺等.响应面法优化天冬多糖的提取条件[J].食品科学,2010,31(6):91-95

[8]Mohsin S,Mahadevan R,Kurup G M.Free-radical-scavenging activity and antioxidant effect of ascophyllan from marine brown algae Padina tetrastromatica[J].Biomedicine&Preventive Nutrition,2013,4(1):75-79

Optimizition Extraction of Polysaccharides from Ginger by Response Surface Methodology and Antioxidant Activity

ZHAO Wen-zhu1，WANG Xin-ke1，YU Zhi-peng1，*，ZHANG Rui-xue1，LI Si-hui1，LIU Jing-bo2，LI Jian-rong1
（1.College of Food Science and Engineering，Bohai University，Jinzhou 121013，Liaoning，China；2.Lab of Nutrition and Functional Food，Jilin University，Changchun 130062，Jilin，China）

2017-01-11

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.006

国家自然科学基金项目（31601479）；渤海大学博士启动项目（0515bs020）

赵文竹（1986—），女（汉），讲师，博士，研究方向：植物活性成分研究。

*通信作者：于志鹏（1984—），男，讲师，博士，研究方向：蛋白质及活性肽的功能研究与产品开发。