2008-2015年石嘴山市手足口病流行病学特征及主要分离株基因序列分析

尤平涛，何 锋，赵秀云，马江涛，赵 瑞

·经验交流·

2008-2015年石嘴山市手足口病流行病学特征及主要分离株基因序列分析

尤平涛1，何 锋1，赵秀云1，马江涛2，赵 瑞1

目的分析手足口病发病情况与流行特征，掌握手足口病病原体的构成及主要分离株基因序列。方法对石嘴山市手足口病疫情资料进行分析，并对主要分离株进行基因测序，根据VP1区核苷酸序列与其他省份以及国外的EV71、CVA16参考株序列构建基因亲缘进化树。结果石嘴山市城区年平均报告发病率高于农业县，每年6、7月是发病高峰期，发病年龄主要集中在0～6岁，以散居、托幼儿童为主，男性发病率明显高于女性。亲缘进化树、核苷酸同源性显示石嘴山市CVA16属于B1基因亚型，EV71属于C4基因亚型。结论石嘴山市手足口病主要流行的EV71、CVA16的基因亚型与全区、全国一致，CVA16是石嘴山市手足口病优势病原体。

手足口病；流行病学特征；基因序列

手足口病是由多种人肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状，容易在入托幼儿中引起手足口病暴发疫情。通过对石嘴山市手足口病疫情资料的分析，了解手足口病发病情况与流行特征，掌握手足口病病原体的构成，并对EV71、CVA16阳性标本进行VP1基因序列特征和分子进化分析。

1 资料与方法

1.1 资料来源：2008-2015年石嘴山市疾控中心共收集全市二区一县具有手足口病症状的患者标本4 238份，标本均为咽拭子、疱疹液。石嘴山市手足口病疫情资料来源于中国疾病监测报告信息系统网络直报疫情信息，实验室资料来源于中心实验室和宁夏疾控中心实验室，人口资料来源于市统计局。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA的提取：按照《手足口病预防控制指南(2008版)》[1]的要求，吸取标本200 μL上清液提取病毒RNA。采用德国Qiagen公司生产的总RNA提取试剂盒提取病毒核酸，操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 标本荧光RT-PCR检测:采用江苏硕世生物科技有限公司生产的柯萨奇病毒CVA16型和肠道病毒EV71型+肠道病毒通用型核酸检测试剂盒(2+1)，按照文献[1]要求对各类标本进行荧光RT-PCR检测，条件为：50℃ 30 min，循环1次；95 ℃ 5 min，循环1次；95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s(检测荧光)，循环45次。结果判定：扩增曲线呈典型S形曲线且Ct值≤35的样本为阳性，Ct值>35或无典型S形扩增曲线的标本为阴性。

1.2.3 病毒分离：核酸检测EV71、CVA16阳性标本预处理后接种到单层、形态良好的Hep-2细胞和RD细胞上，每日观察特征性肠道病毒致细胞病变效应(CPE)的出现，连续盲传两代，当CPE达到75%以上的细胞病变时收获病毒，二代病毒滴度高于一代病毒,选用二代病毒进行鉴定[2]。

1.2.4 序列测定与分析：扩增PCR产物用Qiagen公司生产的QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒纯化，操作步骤按照试剂盒说明书进行，回收产物委托基因公司进行序列测定。测序结果用DNAstar软件进行整理后构建基因进化树，确定基因亚型，并进行核苷酸与氨基酸序列同源性分析。

2 结果

2.1 发病情况分析:8年累积报告4 238例手足口病，实验室诊断1 082例，其余均为临床诊断病例，重症病例2例，无死亡病例。

2.2 地区分布:全市3个县(区)年平均报告发病率：大武口区114.1/10万，惠农区56.0/10万，平罗县50.8/10万。两区一县年平均报告发病率差异有统计学意义(χ2=81.154,P<0.05)。

2.3 时间分布:从2008-2015年手足口病网络直报情况看，每年6、7月达到高峰期，10、11月再次达到高峰期，2009、2012年全年发病主高峰期为10、11月，其他年份发病主高峰期均在6、7月。

表1 石嘴山市2008-2015年手足口病病原学构成分布

2.4 年龄分布特征：发病年龄分布在40岁以下年龄组，病例年龄最大38岁，最小4个月；主要集中在0～6岁儿童，共报告发病3 979例，占报告发病总数的93.89%，其中年平均报告发病率最高是3岁组，各年龄组年平均报告发病率差异有统计学意义(χ2=151.708,P<0.05)。

2.5 性别分布特征:4 238例手足口病病例中，男性2 499例(58.97%)，女性1 739例(41.03%)，男、女性别比为1.44∶1。不同性别年平均报告发病率：男性84.791/10万，女性61.413/10万，不同性别年平均报告发病率差异有统计学意义(χ2=13.488,P<0.05)。

2.6 职业分布特征:从手足口病发病职业构成可见，发病以散居儿童和托幼儿童为主，分别占报告发病总数的45.3%、48.9%，学生占5.9%，其他职业发病很少。

2.7 手足口病病原学分析

2.7.1 手足口病病原学构成：在4 238份样品中，手足口病核酸检测阳性1 082份。其中CVA16病毒545份，构成比50.37%；EV71病毒245份，构成比22.64%；其他肠道病毒292份，构成比26.99%。CVA16为主要病原体(χ2=188.430,P<0.05)。手足口病病毒分离：对核酸检测阳性标本进行病毒分离，利用Hep-2细胞和RD细胞共分离出60株EV71和65株CVA16。

2.7.2 不同年份病原学分布：2014年以EV71为优势病原体，2009年以其他肠道病毒为优势病原体，其他年份均以CVA16为优势病原体。

2.7.3 不同地区手足口病病原学构成分布：大武口区检出手足口病病原体最多，达到50.74%。不同地区CVA16和其他肠道病毒检出率差异有统计学意义(2CVA16=11.678,P<0.05；其他肠道病毒=9.441,P<0.05)

2.8 手足口病主要分离株基因分析

2.8.1 EV71亲缘进化树分析：根据2008-2015年全市50株EV71的VP1区全序列以及GenBank中EV71各基因型及亚型代表序列，构建VP1区基因的EV71系统进化树。进化关系显示，全市EV71与C4亚型C4a分支处于同一个进化分支，与C4a亲缘关系最近,确定全市EV71为C4基因亚型。与EV71原型株(HEV71/BrCr/USA/70)之间遗传距离较远,与2008年安徽阜阳株(EV71/Fuyang.Anhui.P.R.C/17.02/3-2008)和2009年山东株(ZB0002F/SD/CHN/2009/EV71-2009)遗传距离较近，提示石嘴山市流行的EV71与其他省份流行的EV71处于共流行循环状态。从进化树中不难看出，石嘴山市所有EV71进化分支相对独立，但是不同年份EV71集中分布于不同分支上，并且2008年EV71与其他年份遗传距离较远，提示EV71形成了比较独立流行的状态，并且病毒不断进化变异。

2.8.2 EV71分离株VP1编码基因核苷酸同源性分析:通过表2的分析可知，石嘴山市EV71与C型代表株C4亚型核苷酸同源性最高。同一年份EV71同源性均高于7年间分离株总的核苷酸同源性，石嘴山市流行的EV71在时间分布上存在遗传进化差异。

表2 2008-2015年石嘴山市50株地方株EV71核苷酸同源性分析结果

2.8.3 CVA16进化树分析:将58株CVA16与GenBank中获得国内外参考株VP1区基因序列一起构建基于VP1基因序列的进化树。从整体上看，2010-2015年全市CVA16的基因型为B1亚型，大部分CVA16分布在B1b基因亚型分支上。与2008年山东株(H060F/SD/CHN/2008)遗传距离近，亲缘性好，与国外的毒株遗传距离较远，亲缘性差，说明石嘴山市的基因型与国内其他省份存在共循环流行。但2010年3株和2015年1株分布在B1a基因亚型分支上，与其他毒株遗传距离较远，提示存在不同的传播链。

2.8.4 CVA16分离株VP1编码基因核苷酸同源性分析：通过表3的分析可知，石嘴山市CVA16与B型代表株B1亚型核苷酸同源性最高。各年份CVA16核苷酸同源性均高于6年来总的核苷酸同源性，石嘴山市流行的CVA16在时间分布上存在遗传进化差异。

表3 2010-2015年石嘴山市58株地方株CVA16核苷酸同源性分析结果

3 讨论

对手足口病疫情的监测，摸清了石嘴山市手足口病发病特征，为采取防控措施提供了科学性依据。从两区一县每年的发病率来看，城区发病率明显高于以农村为主的平罗县[2]，这可能是因为城区儿童入托率高于农村儿童，幼儿园儿童较聚集，容易造成手足口病暴发传播[3-4]；发病年龄主要集中在0～6岁，反映低龄儿童人群免疫力水平低，良好的卫生习惯还没有形成；以散居儿童和托幼儿童为主，这与国内其他研究结果一致；男性发病率明显高于女性，男、女性别比与宁夏手足口病病例性别比基本一致[5]，与男性活动范围、活动内容、活动强度和女性不同有关。

通过病原学监测发现，全市手足口病流行的主要病原体是CVA16，这与宁夏手足口病主要病原体是一致的[6]；但是不同年份流行的主要病原体也不相同，这与手足口病病毒血清型较多有关，人通过显性感染和隐性感染后均可获得比较牢固的特异性免疫力，不同血清型间鲜有交叉免疫[1]，当某一血清型形成免疫屏障时，就容易造成其他血清型手足口病病毒的流行；全市CVA16是B基因型B1亚型，这与宁夏、北京、南京等地研究是一致的，B1亚型在我国其他地区及周边国家广泛分布和流行[7-8]，表明全市CVA16与我国其他省市和周边国家地区的CVA16存在共同进化共同循环。全市CVA16分属于B1a和B1b两条进化分支，表明这两条进化分支的CVA16在全市共循环。全市EV71是C4亚型C4a分支，这与宁夏、杭州、南京等地研究也是一致的[3,8-10]，表明全市、全区、全国乃至亚太其他地区流行的EV71均以C4亚型为主[8]。从全市每年病原体检测情况来看，全市手足口病以不同基因型或基因亚型的CVA16、EV71和其他肠道病毒共同循环。

为了有效控制手足口病的流行，一是要加强儿童父母以及托幼机构卫生知识宣教，培养父母和孩子良好的个人卫生习惯，定期对孩子接触物品进行清洁晾晒，室内定时通风换气。二是根据中国疾控中心《肠道病毒71型灭活疫苗使用技术指南》[11]，鼓励0～5岁儿童接种疫苗，有效降低儿童手足口病的发病率。三是教育部门加强对托幼机构的监管力度，落实晨午检等制度，及时采取措施控制疫情的发展。四是疾控机构加强疫情监测和病原体检测，掌握疫情流行规律，关注病原体进化程度，根据病原谱的变化及时发布预警信息，从而有效控制手足口病的流行。

[1] 国家卫计委.手足口病预防控制指南(2008版)[EB/OL][2017-07-17].http://www.nhfpc.gov.cn/zwgkzt/wsbysj/200805/34775.shtml.

[2] 雷静，范晓宇，胡皓，等.银川市2008-2009年手足口病流行特征及病原学监测分析[J].宁夏医科大学学报，2011，33(8)：742-745.

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[11] 中国疾病预防控制中心.肠道病毒71型灭活疫苗使用技术指南[EB/OL].(2017-03-31)[2017-07-17].http://www.chinacdc.cn/zxdt/201606/t20160608_131032.html.

10.13621/j.1001-5949.2017.09.0847

1.宁夏石嘴山市疾病预防控制中心，宁夏 石嘴山 753000 2.宁夏疾病预防控制中心，宁夏 银川 750004

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2017-03-31责任编辑马兴忠