水蛭素对喉癌荷瘤小鼠的抑瘤作用研究

马 涛，刘为民，曲 琳，杨笑染，薛希均，刘铭芳，邓 斌，周智勇，陶宝鸿

·临床研究·

水蛭素对喉癌荷瘤小鼠的抑瘤作用研究

马 涛1，刘为民1，曲 琳1，杨笑染1，薛希均2，刘铭芳1，邓 斌1，周智勇1，陶宝鸿3

目的观察水蛭素对喉癌荷瘤小鼠的抑瘤作用。方法将40只小鼠随机分为4组，每组10只，小鼠左前腋窝下皮下种瘤建立实体瘤模型，阳性对照组以氟尿嘧啶20mg/kg腹腔注射；水蛭素高剂量组以2.5g/(kg·d)灌胃；阴性对照组以生理盐水0.1mL/(10g·d)灌胃；水蛭素低剂量组以1.2g/(kg·d)灌胃。连续用药14 d后处死小鼠取荷瘤鼠肿块称重，并将瘤组织包埋、固定、切片、染色等，计算抑瘤率，利用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件检测瘤组织中C-met的表达。结果水蛭素高、低剂量组对小鼠喉癌细胞均有明显的抑制作用，抑瘤率分别为40.1%、26.92%，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；4组中C-met均呈阳性表达，水蛭素高、低剂量组C-met的表达均下调，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论水蛭素对小鼠喉癌细胞抑制作用显著。

水蛭素;喉癌;C-met;抑瘤作用

美国的一项研究分析表明喉癌的发病率占头颈癌的25%[1]，我国喉癌的发病率约占全身癌症的1%～5%[2]。从水蛭中可以提取出一种活性成分较高的物质——水蛭素(Hirudin),它可以抑制凝血酶。多项研究表明在全身肿瘤中，C-met基因均呈现过度表达。本研究中，我们建立喉癌荷瘤小鼠模型，观察水蛭素对小鼠喉癌的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料：2015年自宁夏医科大学动物中心购买小鼠雌雄各半共40只，周龄(8±1)周，体质量(20±0.5)g。小鼠喉癌瘤细胞由南京科佰科技有限公司提供。自上海信裕生物科技公司购买重组人水蛭素；自天津金耀氨基酸公司购买氟尿嘧啶注射剂，规格10 mL，25 g/支；自北京哲成科技有限公司购买C-met SP免疫组织化学检测试剂盒。光学显微镜、恒温干燥箱由宁夏人民医院病理科提供；台式高速离心机由宁夏人民医院检验科提供。

1.2 实验方法

1.2.1 分组： 将40只小鼠随机分为A、B、C、D 4组(A为阴性对照组、B为高剂量水蛭素组、C为阳性对照组、D为低剂量水蛭素组)，每组10只。

1.2.2 模型动物：抽取荷瘤喉癌小鼠瘤细胞(传代6～8 d)，细胞浓度调节至3×106个/mL(利用灭菌注射用水稀释)，各个小鼠左腋下严格消毒后皮下接种0.1 mL，接种后第2天开始给药：A组胃内注入生理盐水，浓度0.1 mL/(10 g·d)；B组水蛭素胃内注入，浓度2.5g/(kg·d)； C组用氟尿嘧啶腹腔注射，浓度20 mg/(kg·d)；D组水蛭素胃内注入，浓度1.2 g/(kg·d)。每日1次，每次0.5 mL，连续用药14 d后处死小鼠并称重量，然后切开、分离、切除肿物并称各自瘤质量，计算抑瘤率。

1.2.3 抑瘤率计算[3]:以百分比(%)表示,抑留率=(A组肿瘤质量均值-B/C/D组肿瘤质量均值)/A组肿瘤质量均值×100%。

1.2.4 检测C-met在肿瘤组织中的表达(免疫组化法)：用甲醛液(浓度10%)固定切除下来的瘤组织，然后对标本进行脱水、包埋、切片(厚度约4 μm)，对已经备好的切片脱蜡、脱水、冲洗，然后加入3%过氧化氢封闭内源性过氧化氢10 min，枸橼酸盐缓冲液抗原封闭，100 ℃条件下10min，经过自然冷却至室温后，常温下进行PBS冲洗。PBS冲洗后标本内加入血清封闭，室温放置10 min，然后去除血清后加入C-met一抗，4 ℃过夜，PBS冲洗3次各5 min后，标本内加入聚合物辅助剂，在37 ℃条件下经过20 min，再次PBS冲洗，加入IgG多聚体，在37 ℃条件下经过20 min，重复利用PBS进行标本的冲洗，然后经过显色、复染、脱水、封片。

1.2.5 结果判定:利用分析软件计算出平均光密度值，用此值代表C-met在组织表达水平的数值。

1.3 统计学方法:采用SPSS 11.0统计软件，计量资料比较采用方差分析。

2 结果

2.1 瘤质量的测定:试验结果通过抑瘤率的计算，水蛭素高剂量组、阳性对照组、水蛭素低剂量组的抑瘤率分别为40.10%、59.89%、 26.92%。与阴性对照组比较，水蛭素高、低剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，阳性对照组差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组瘤质量及抑瘤率比较

注：*与阴性对照组比较，P<0.05。

2.2 C-met的表达:将棕黄色的C-met的表达定义为阳性，本研究中不同的组别均表现为阳性表达，但除阴性对照组外，其余组别均表现为表达下降(图1，目录后)，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 4组C-met平均光密度值表达情况

注：*与阴性对照组比较，P<0.05。

3 讨论

现代医学表明，高凝状态是大多肿瘤患者血液的特定表现形式，而这样的高凝状态决定了抗癌药物很难被吸收而发挥作用[4]。水蛭为环节动物水蛭蚂蟥宽体金线蛭，具有很强的活血功效，Hirudin则是在水蛭中提取出的最具活性的一种成分，具有强大的抑制凝血酶的作用。研究表明，Hirudin能显著降低血液黏度，具有抗凝、抗血栓的作用[5]，这种功效有利于药物进入组织杀灭肿瘤细胞，促使肿瘤细胞逐步走向凋亡[6-7]，从而使其抗肿瘤效力得以发挥。此次实验的各项数据提示，对于荷瘤鼠喉癌，Hirudin能明显抑制肿瘤的发生，其抑瘤率在高、低剂量组分别为40.10%、26.92%。

C-met是肝细胞生长因子受体(HGFR)，在正常组织中表达很低。研究表明，在多种肿瘤患者中，分子机制可以激活C-met，均检测出C-met高水平表达[8]和基因扩增。因此认为，C-met高表达与肿瘤的发生和转移密切相关，C-met高表达，能使肿瘤细胞的活跃程度和对周围组织、全身的破坏性明显增加，在肿瘤的浸润和转移中扮演重要角色。本次试验研究结果发现，不同分组中，C-met均呈阳性表达，但是在高、低剂量组其表达下降。多组均数比较发现，差异有统计学意义(P<0.05)，表明Hirudin能抑制喉癌实体瘤C-met的表达，具有明显的抗肿瘤作用，这可能是Hirudin抗喉癌的作用机制。

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Inhibitoryeffectofhirudinonthelaryngealcarcinomatumor-bearingmice

MATao1,LIUWeiming1,QULin1,YANGXiaoran1,XUEXijun2,LIUMingfang1,DENGBin1,ZHOUZhiyong1,TAOBaohong3.

1.DepartmentofOtorhinolaryngology,NingxiaPeople’sHospital,Yinchuan750002；2.DepartmentofOtorhinolaryngology,KunmingGeneralHospitalofPLA,Kunming650021,China；3.TaizhouMunicipalHospital，Taizhou318000,China

Correspondingauthor:LIUWeimin,Email：lwm2313@163.com

AbstractObjectiveTo investigate the inhibitory effect of hirudin on the laryngeal carcinoma tumor-bearing mouse.Methods40 mice were randomly divided into 4 groups (n=10),and planted with laryngeal cancer cells subcutaneous at the left armpit to set the tumor model.In positive control group,mice were intraperitoneal injected with fluorouracil (20 mg/kg);in negative control group,mice received NS 0.1ml/ (10 g·d),in high-dose hirudin group,mice were accepted 2.5 g/(kg·d).While low-dose hirudin group received 1.2 g/(kg·d).Mice were sacrificed after continuously treatment for 14 days,and the tumor were taken and weighed,the tumor tissue were prepared for immunostaining to calculate the tumor inhibition rate and the expression of C-met.ResultsBetween the high-dose and low-dose of hirudin inhibited the laryngeal cancer cells,the tumor inhibition rate was 40.1%,26.92% respectively,which had significant difference compared with control group (P<0.05),C-met positive staining was observed in 4 groups while the expression was down-regulated in both high-dose and low-dose hirudin groups,which had significant difference compared with control (P<0.05).ConclusionThe inhibitory effect of hirudin is significant on the laryngeal carcinoma tumor-bearing mice.

Hirudin;Laryngealcancer;C-met;Tumorsuppressioneffect

10.13621/j.1001-5949.2017.09.0792

宁夏自然基金资助项目(NZ1319)

1.宁夏人民医院耳鼻咽喉科，宁夏 银川 750002 2.解放军昆明总医院耳鼻咽喉科，云南 昆明 650021 3.浙江省台州市市立医院，浙江 台州 318000

刘为民,Email：lwm2313@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170926.1024.024.html

R739.65

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2017-05-25责任编辑马兴忠