蒙古冰草苗期抗旱相关microRNA的差异表达分析及靶基因预测

马艳红，张旭婷，于肖夏，刘旭婷，高 慧，于 卓

(内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特 010019)

蒙古冰草苗期抗旱相关microRNA的差异表达分析及靶基因预测

马艳红，张旭婷，于肖夏，刘旭婷，高 慧，于 卓

(内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特 010019)

为明确蒙古冰草抗旱相关microRNA(miRNA)的表达特征及其靶基因，利用实时荧光定量PCR技术，对前期测序筛选到的4个miRNA(amo-miR21、amo-miR44、amo-miR62、amo-miR82)在干旱胁迫下的苗期差异表达情况进行了定量验证，用Target Finder软件和psRNATarget数据库在线预测其靶基因，并用MegAlign软件对预测的靶基因进行了同源性比对分析。结果表明，干旱胁迫下，蒙古冰草中amo-miR21、amo-miR82和amo-miR62的表达量呈上调趋势，而amo-miR44的表达呈下调趋势，与前期测序结果相符；4个miRNA共预测出32个靶基因，其中，amo-miR44在玉米、水稻和小麦数据库中未发现同源的靶基因，在拟南芥、大麦、蒺藜苜蓿中发现的靶基因相似性较低；而amo-miR21、amo-miR82和amo-miR62的靶基因均与小麦中预测的靶基因存在较高同源性(68.6%～95.6%)，推测这3个靶基因是参与干旱逆境胁迫响应的基因。

蒙古冰草；干旱胁迫；microRNA；荧光定量RT-PCR；靶基因预测

Abstract:In order to know the expression characteristics and target gene of drought-responsive microRNA(miRNA) inAgropyronmongolicumKeng,the temporal expression of four miRNA(amo-miR21,amo-miR44,amo-miR62 and amo-miR82) under drought stress treatment at seedling stage were monitored by fluorescent quantitative real-time polymerase chain reaction,of which miRNA have been selected based on the previous researches of small RNA-seq. Their target genes were predicted by Target Finder software and psRNATarget database,and the homology were analyzed with MegAlign. The results showed that amo-miR21,amo-miR82 and amo-miR62 were significantly up-regulated in leaves,while amo-miR44 was down-regulated under drought stress,and the expression of the four miRNA were consistent with sequencing data. Thirty-two target genes of the four miRNAs ofA.mongolicumwere predicted by Target Finder software and homologously searched in psRNATarget database. The homologous target genes of amo-miR44 are not found in corn,rice or wheat database,and the similarity index of target gene sequence pairs fromA.mongolicumandArabidopsisthaliana,Hordeumvulgare,Medicagotruncatulais low. The three target genes of amo-miR21,amo-miR82,and amo-miR62 are homologous with the target genes fromTriticumaestivum(68.6%-95.6%),which can be speculated as drought-responsive genes.

Keywords:AgropyronmongolicumKeng; Drought stress; microRNA; Fluorescent quantitative RT-PCR; Target gene prediction

蒙古冰草(AgropyronmongolicumKeng)为小麦族冰草属(Agropyron)二倍体多年生牧草，是耿以礼教授于1938年发现的新种，模式标本产地为内蒙古乌兰察布盟的百灵庙地区[1-2]，在内蒙古集中分布在浑善达克沙地和嘎亥额勒苏沙地，为典型的寒旱生植物，其根系发达、具沙套、返青早、分蘖多、抗旱性极强，是麦类作物抗旱性改良的优良基因资源[3-5]。

MicroRNA(miRNA)是植物体内普遍存在的长度约21～25 nt的内源单链小分子非编码RNA，其与靶mRNA序列的互补程度决定其对靶mRNA的剪切或翻译的阻遏，主要在转录后水平进行调控，是mRNA表达的关键调控因子之一[6-7]。miRNA数据库miRBase(miRBase V21.0)共收录了223个物种的35 828个成熟的miRNA，涵盖了73个植物种的849个miRNA。大量研究表明，miRNA在植物的生育、细胞分化、抗非生物胁迫等过程中发挥重要作用[6,8]。目前，针对miRNA响应干旱胁迫并参与调控的研究已在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、烟草(NicotianatabacumL.)、大豆(GlycinemaxL.)、玉米(Zeamays)、小麦(Triticumaestivum)、杨树(PopulustrichocarpaL.)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、大麦(Hordeumvulgare)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、桃(Prunuspersica)、拟二粒小麦(Triticumdicoccoides)、沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)等植物中有相关报道，研究发现，与抗旱相关的miRNA有miR156、miR159、miR167、miR168、miR171、miR172、miR319、miR393、miR394a、miR395、miR396、miR397、miR161、miR168、miR169等[9-14]。但至今尚未见有关于蒙古冰草抗旱相关miRNA的研究报道。

本试验在前期对蒙古冰草Solexa高通量测序及生物信息学分析的基础上，利用荧光定量RT-PCR技术对选出与抗旱性显著相关的4个新预测的保守miRNA(amo-miR21、amo-miR44、amo-miR62和amo-miR82)进行定量分析，并对其靶基因进行预测，以期为阐明蒙古冰草抗旱相关miRNA调控机制及其靶基因的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料及干旱处理

供试材料为野生蒙古冰草，其种子采集于内蒙古乌兰察布百灵庙镇。

挑选籽粒饱满的蒙古冰草种子，种植于装有花卉土与蛭石混合(1∶1)的花盆(直径20 cm，深30 cm)中，每盆播种50粒种子，共24盆，置人工气候室内培养，室内昼夜温度25±5 ℃，光强30 000 lx，光照时间14 h，定量浇水，湿度65%。待幼苗长至15 cm时，分成对照和处理两组，处理组进行断水干旱胁迫，胁迫天数为3、6、9、12、15、18、21 d(21 d干旱处理后，叶片较干枯，复水后仅有少数植株成活，为水分胁迫的临界点)，3次重复，每个处理同期取15株幼苗叶片等量混合，立即于液氮中速冻，-80 ℃冰箱中保存。

1.2 miRNA表达的荧光定量RT-PCR检测

1.2.1 总RNA提取及miRNA反转录

取冻存的样本经液氮研磨后，利用Trizol法提取各处理及对照的总RNA。取2 μL RNA原液稀释至10 μL，用1%的琼脂糖凝胶电泳20 min后，检测其完整性和纯度。各处理及对照样品总RNA采用TianGen公司生产的miRcute miRNA cDNA 第一链合成试剂盒(KR211)反转录成cDNA。反转录反应体系包括2 μL的2×逆转录缓冲液、2 μL RNA模板、1.2 μL逆转录引物、0.2 μL MMLV逆转录酶(200 U·μL-1)，加DEPC水至总体积20 μL。反应条件：26 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min。反转录产物于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 荧光定量RT-PCR

用Excel 2007软件进行数据表格整理及柱形图绘制，用SAS 9.0软件进行方差及差异显著性分析。

表1 荧光定量RT-PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-PCR

1.3 靶基因预测及生物信息学分析

利用Target Finder[18]软件对蒙古冰草4个新预测miRNA进行靶基因预测，并用BLAST软件[19]将预测得到的靶基因序列与nr[20]、Swiss-Prot[21]数据库比对，获得靶基因序列的注释信息。同时，在植物microRNA靶基因数据库psRNATarget[22](http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)中，基于模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)、烟草(NicotianatabacumL.)及禾本科植物小麦(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、大麦(Hordeumvulgare)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、豆科牧草蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的基因组数据预测靶基因(Scoring Schema为Schema V2，2017 release)，成熟的miRNA与其靶基因之间的错配碱基不超过3个。

用软件DNAstar中MegAlign[23]对蒙古冰草4个miRNA预测得到的靶基因进行多序列比对及相似度分析。

2 结果与分析

2.1 蒙古冰草总RNA的质量

利用Trizol法提取7个干旱处理及对照样品的总RNA后，采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果(图1)显示，28S rRNA、18S rRNA条带清晰稳定，RNA无降解，未出现DNA污染。OD260/280值在1.8～2.1之间。说明RNA含量和质量均符合PCR扩增要求。

CK：对照；1～7：干旱处理3、6、9、12、15、18、21 d。

CK:Control; 1-7:Drought stress treatment for 3,6,9,12,15,18,and 21 d.

图1蒙古冰草干旱处理后总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果

Fig.1TotalRNAofA.mongolicumunderdroughtstressdetectedbyagarosegel

2.2 与抗旱性相关的4个新预测miRNA的真实性

根据4个新预测的miRNA(amo-miR21、amo-miR44、amo-miR62和amo-miR82)前体序列设计茎环状特异引物，以 U6作为内参基因，进行RT-PCR扩增，结果(图2)显示，这4个miRNA均能在7个干旱处理及对照样品中检测到，是一条片段大小约为100 bp的清晰条带，与预期片段大小一致，表明这4个miRNA是真实存在的。

2.3 与抗旱性相关的4个新预测miRNA的表达分析

以 U6为内参基因，将蒙古冰草未经干旱胁迫的miRNA表达量作为对照，设其为1，然后分别计算出各干旱处理中的miRNA相对表达量(图3)。由图1可知，蒙古冰草中amo-miR21、amo-miR62和amo-miR82的表达量随着干旱胁迫时间的延长均呈上升趋势，在干旱胁迫21 d时，其表达量分别较对照增加2.39、2.60和2.46倍；另外，干旱处理15、18和21 d时，这3个miRNA的表达量差异不显著，表明干旱15 d时蒙古冰草的miRNA表达为极限表达。amo-miR44的表达量呈下降趋势，干旱处理条件下的表达量极显著低于对照，干旱处理21 d时的表达量较对照降低69.9%。

M：核酸分子量标准DL2000；CK：对照；1～3:3次重复。

M：DNA marker DL2000；CK：Control；1-3：Three replicates.

图2干旱处理后蒙古冰草中与抗旱性相关的4个新预测miRNA的电泳检测结果

Fig.2Electrophoretogramforthefournoveldrought-responsivemiRNAofA.mongolicumunderdroughtstress

图注上不同字母表示处理间差异在0.01水平上显著。

Different letters above the columns mean significant difference among different treatments at 0.01 level.

图3干旱胁迫下蒙古冰草中miRNA的相对表达量

Fig.3RelativeexpressionlevelofmiRNAinA.mongolicumunderdroughtstress

2.4 与抗旱性相关的4个新预测miRNA的靶基因

利用Target Finder软件预测分析发现，amo-miR21、amo-miR44和amo-miR82各有1个靶基因，其分别编码光合系统II中的蛋白、PPR家族蛋白和泛素-蛋白酶体系统中的蛋白，amo-miR62有2个靶基因，编码过氧化物还原酶和在线粒体中发挥作用的PPR蛋白家族。

在植物microRNA靶基因预测数据库psRNATarget中，与模式植物拟南芥(A.thaliana)、烟草(N.tabacum)及禾本科作物大麦(H.vulgare)、小麦(T.aestivum)、水稻(O.sativa)、玉米(Z.mays)、二穗短柄草(B.distachyon)和豆科牧草蒺藜苜蓿(M.truncatula)数据进行比对，这4个miRNA共有27个靶基因(表2)，且每个miRNA预测调控的靶基因数目不同。amo-miR62靶基因数最多，为9个，amo-miR21、amo-miR44和amo-miR82的靶基因数均为6个。尽管其中一部分靶基因没有描述，但部分靶基因功能多种多样，如光系统II反应中心M蛋白、α/β超家族蛋白水解酶、葡萄糖胺N-酰基转移酶、抗坏血酸过氧化物酶、转座子基因、假想蛋白等，一些参与干旱逆境胁迫响应过程(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)。

2.5 预测的miRNA靶基因同源性

对Target Finder预测的靶基因与psRNATarget在线预测的靶基因进行序列比对分析发现，amo-miR21的靶基因与玉米Z.mays-GRMZM2G030695-T01的相似性指数为70.9%，与玉米Z.mays-GRMZM2- G055151-T01的相似性指数为84.2%，与小麦T.aestivum-CA679344的相似性指数高达95.6%，该基因注释为光系统II反应中心M蛋白；amo-miR44的靶基因与拟南芥A.thaliana-AT4G06540.1的相似性指数为41.4%，与苜蓿M.truncatula-Medtr7g047630.1的相似性指数最高，也仅为46.2%，与大麦H.vulgare-TC256962的相似性指数为29.6%，均较低；amo-miR62靶基因2与玉米Z.mays-GRMZM2 G085845_T01的相似度为31.7%，与小麦T.aestivum-CA610180的相似性指数为48.2%，与短穗二柄草B.distachyon-Bradi2g52000.1的相似性指数为28.9%，与水稻O.sativa-LOC_Os02g28530.1的相似性指数为28.6%，与小麦T.aestivum-CA610180的相似性指数为40.2%，均较低；而amo-miR62的靶基因1和小麦中预测到的靶基因T.aestivum-TC459743的相似性指数高达91.3%，该基因注释为抗坏血酸过氧化物酶；amo-miR82的靶基因与小麦T.aestivum-TC461760的相似性指数高达68.6%，相似度较高，该基因注释为醛氧化酶-2。这表明蒙古冰草amo-miR21和amo-miR82的靶基因及amo-miR62的靶基因1与小麦中预测到的靶基因存在同源性。

表2 Target Finder和psRNATarget预测的靶基因Table 2 Target genes predicted by Target Finder and psRNATarget

3 讨 论

蒙古冰草是干草原和荒漠草原上抗旱性强的丛生禾草，亦是麦类作物遗传改良的宝贵野生近缘种，挖掘野生蒙古冰草的抗旱基因资源对于拓宽麦类作物的遗传基础具有重要意义。干旱是农作物生长发育最为严重的逆境胁迫之一，近年来大量研究报道表明，miRNA在干旱胁迫中起到重要调控作用，抗旱相关miRNA同作物遗传改良中的新功能基因一样重要，急需研究利用。RT-PCR是目前miRNA定量表达分析最常用且快速有效的方法之一[16]。本试验选取前期蒙古冰草高通量测序获得的4个抗旱相关的miRNA，利用荧光定量RT-PCR检测其在不同干旱胁迫进程中的表达情况，结果发现，amo-miR21、amo-miR82和amo-miR62表达量在干旱胁迫15、18、21 d间差异不显著，表明干旱15 d时蒙古冰草的miRNA表达为极限表达。随着对蒙古冰草幼苗干旱胁迫处理天数的增加，amo-miR21、amo-miR82和amo-miR62的表达量呈上升趋势，而amo-miR44的表达量呈下降趋势，与前期的miRNA测序结果是一致的。根据MiRDeep软件的保守性分析发现，amo-miR21、amo-miR44、amo-miR62和amo-miR82的不同物种的相似miRNA分别为bdi-miR5180b[9]、ath-miR854a[24]、zma-miR164g-3p[25]和bdi-miR5066[26](相似性分别为42.0%、30.7%、26.13%和43.5%)，其中，bdi-miR5180b和bdi-miR5066未见有试验验证，zma-miR164g-3p和ath-miR854a响应生物逆境胁迫。本试验中4个miRNAs在干旱胁迫响应中的功能有待进一步验证。

miRNA的重要研究价值体现在其能够调控靶基因的表达，预测和鉴定miRNA靶标基因是分析miRNA功能的前提。因植物体内miRNAs与其调控的靶基因序列近乎完全匹配，用生物信息学预测靶基因的方法更方便。利用已开发的Target Finder、PatScan、psRNATarget等软件，通过同源性搜索和在线软件预测植物miRNA靶标基因的方法得到了广泛应用[27]，如：Zhang等[28]利用在线预测软件miRU(http://bioinofo3. noble. Org/ miRU. htm)对60个植物的miRNA靶基因预测得到了较好的结果，Kohli等[29]利用二代测序技术获得了鹰嘴豆的122个保守miRNA和59个新miRNA，用psRNA-Target(http://plantgrn.noble.org /psRNATarget/)预测到358个靶基因。本试验用Target Finder和psRNA-Target分别成功地预测到5个和27个靶基因，同源性比对发现蒙古冰草amo-miR21的靶基因、amo-miR62的靶基因1和amo-miR82的靶基因与小麦的靶基因(T.aestivum-CA679344、T.aestivum-TC459743、T.aestivum-TC461760)存在较高的同源性(68.6%～95.6%)，靶基因功能依次注释为光合系统II、过氧化物还原酶II、泛素-蛋白酶体系统中的蛋白，它们与干旱逆境胁迫响应有关，这为下一步蒙古冰草抗旱相关miRNA及其靶基因的功能验证奠定了基础。

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DifferentialExpressionAnalysisofDrought-ResponsiveMicroRNAandPredictionofTheirTargetGenesinAgropyronmongolicumatSeedlingStage

MAYanhong,ZHANGXuting,YUXiaoxia,LIUXuting,GAOHui,YUZhuo
(Agronomy College,Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot,Inner Mongolia 010019,China)

时间：2017-09-13

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170913.1138.010.html

S512.9；S330

A

1009-1041(2017)09-1168-07

2017-01-28

2017-07-18

国家自然科学基金项目(31360573)

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于 卓(E-mail：yuzhuo58@sina.com)