四倍体小麦Langdon HMT1基因的克隆及原核表达

吴丽军，尚 玥，刘 韬，陈文杰，刘宝龙，张连全，刘登才，张 波，张怀刚

(1.中国科学院西北高原生物研究所，青海西宁 810001； 2.中国科学院大学，北京100049； 3.青海省作物分子育种重点实验室，青海西宁 810001； 4.四川农业大学小麦研究所，四川成都 611130)

四倍体小麦Langdon HMT1基因的克隆及原核表达

吴丽军1,2，尚 玥1,2，刘 韬1,2，陈文杰1,3，刘宝龙1,3，张连全4，刘登才4，张 波1,3，张怀刚1,3

(1.中国科学院西北高原生物研究所，青海西宁 810001； 2.中国科学院大学，北京100049； 3.青海省作物分子育种重点实验室，青海西宁 810001； 4.四川农业大学小麦研究所，四川成都 611130)

硒是人类不可缺少的重要微量元素之一，人类必须补充足够的硒才能保证身体健康。同型半胱氨酸甲基转移酶(homocysteine-S-methyltransferase，HMT)基因与植物富硒关键酶硒代半胱氨酸甲基转移酶(selenocysteine methyltransferase，SMT)基因同源。为了发掘并利用麦类作物中的富硒关键酶基因，基于NCBI已公布的节节麦(AegilopstauschiiCoss.)同型半胱氨酸甲基转移酶1基因( AetHMT1)的序列设计 HMT1基因的特异性引物H1-F/H1-R，克隆四倍体小麦Langdon HMT1的开放阅读框(open reading frame，ORF)后进行序列分析，并通过原核表达验证该基因。结果表明，利用H1-F/H1-R从四倍体小麦Langdon(LDN)克隆出两条长度均为975 bp的序列，分别命名为 LDNHMT1-1和 LDNHMT1-2。 LDNHMT1-1、 LDNHMT1-2与 AetHMT1基因一样，均编码342个氨基酸，分子量大小分别为35.19 kDa和35.18 kDa。通过氨基酸序列比对和进化树分析发现， LDNHMT1-1、LDNHMT1-2与其他HMT、SMT有较高的相似性。构建原核表达载体，并通过SDS-PAGE鉴定，成功获得 LDNHMT1-1、 LDNHMT1-2的原核表达菌株，且原核表达的蛋白质与预测分子量大小一致。

四倍体小麦Langdon；硒；同型半胱氨酸甲基转移酶；基因克隆；原核表达

Abstract: Selenium is one of the most important essential trace elements for humans and enough selenium must be supplemented to ensure body health. Homocysteine-S-methyltransferase(HMT) is homologous to selenocysteine methyltransferase(SMT),which is the key enzyme to enrich selenium for plants. In order to explore and use the key enzyme genes of selenium-rich in wheat crop,we designed especial primers H1-F/H1-R to clone the open reading frame(ORF) of the HMT1 in tetraploid wheat Langdon,based on the sequence of homocysteine-S-methyltransferase 1 gene fromAegilopstauschiiCoss.( AetHMT1) from NCBI and finally verified through the method of prokaryotic expression. The results showed that two sequences with the same size of 975 bp from Langdon(LDN) were cloned,respectively,named LDNHMT1-1 and LDNHMT1-2. Like the AetHMT1,the LDNHMT1-1 and LDNHMT1-2 genes both encode 342 amino acids,with the molecular weight of 35.19 kDa and 35.18 kDa,respectively. The LDNHMT1-1 and LDNHMT1-2 have high similarity with other HMTs and SMTs,based on amino acid sequence alignment and phylogenetic tree analysis. We successfully gained the prokaryotic expression strains of LDNHMT1-1 and LDNHMT1-2 by the way of constructing the prokaryotic expression vector and SDS-PAGE. The protein molecular weight of prokaryotic expression was consistent with the predicted one.

Keywords: Tetraploid wheat Langdon; Selenium; Homocysteine-S-methyltransferase; Gene cloning; Prokaryotic expression

硒是人类不可缺少的微量元素之一，而人体内却无法产生硒，必须通过食物补充足够的硒才能保证身体健康[1]。无机硒对人体是有毒性的，依靠植物将无机硒转化为有机硒可以被人类吸收利用[2]。自然界中富硒的植物不多，能用来日常补硒的更少。有研究表明，生物大分子的甲基化作用在信号传导[3]、DNA修复[4]、生物大分子合成[5-6]和硒解毒[7-8]等过程中发挥着重要的调节作用[9]。而S-同型半胱氨酸甲基转移酶(homosysteine-S-methyltransferase,HMT)可以利用S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体将同型半胱氨酸(Hcy)转化为S-腺苷同型半胱氨酸和甲硫氨酸[10]。此酶与植物富硒的关键酶硒代半胱氨酸甲基转移酶(selenocysteine methyltransferase,SMT)起源于同一祖先[11]，具有类似的活性结构[12]。SMT可以将甲基转入硒代半胱氨酸产生非蛋白氨基酸即硒甲基硒代半胱氨酸，在高硒植物的解除硒毒性中起着关键作用[13]。

四倍体硬粒小麦(AABB)作为普通小麦的近缘物种，在小麦中种植面积居第二，约占世界小麦的10%[14]。四倍体小麦Langdon具有硬粒小麦的共同特点，即耐旱、耐瘠薄、蛋白质含量高、营养价值高和工艺性能好[15]，是小麦育种的优异供体材料。S-同型半胱氨酸甲基转移酶与植物富硒关键酶SMT结构相似，具有类似的活性结构，且甲基化对硒解毒[7-8]具有重要的调节作用[9]，据此推测其对硒的吸收可能具有调节作用。研究表明，节节麦(AegilopstauschiiCoss.)的硒含量要高于作为大部分地区主食的小麦[16]，且是小麦的二倍体供体祖先，可以以节节麦为基础进行其他麦类作物的硒研究。节节麦 HMT1基因序列已公布，本研究根据已公布的节节麦 HMT1基因，研究四倍体硬粒小麦Langdon中的 HMT1基因，以期为富硒小麦的研究打下理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试材料

供试材料为四倍体硬粒小麦Langdon，由四川农业大学提供，并由青海省作物分子育种重点实验室繁育、保存。

1.1.2 主要试剂

1.2 方 法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA第一条链的合成

培养Langdon至三叶一心期，用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取叶片总RNA，并用1.0%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA的完整性及浓度，最后保存于-80 ℃备用。以Oligo(dT)18为引物，以1 μg总RNA为模板，按照RevertAid第一链cDNA合成试剂盒的操作说明书合成第一链cDNA。

1.2.2 HMT1基因的PCR扩增

根据NCBI已公布的节节麦 HMT1基因(KD510783.1)序列，利用Primer Premier 5.0设计可扩增 HMT1基因完整编码区的特异性引物H1-F/H1-R(H1-F：5′-ATGGCCGGGGTGGTG GA-3′，H1-R：5′-TCACTGGCCGTTCCTGCT CTT-3′)，并交由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。以Langdon叶片总RNA逆转录合成的cDNA为模板，利用引物H1-F/H1-R进行PCR扩增。PCR反应体系20 μL：模板cDNA 0.5 μL，上下游引物各0.5 μL，Phusion DNA聚合酶0.2 μL，5×HF buffer 4 μL，dNTPs 1.6 μL，ddH2O 12.7 μL。PCR反应程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，69 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。利用1.0%琼脂糖凝胶电泳30 min分离检测PCR产物并切胶回收纯化目的条带(回收步骤参照DNA凝胶回收纯化试剂盒说明)，最后72 ℃ 30 min加A，体系为：每20 μL产物加10×buffer 2 μL，dNTPs 1.6 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL。

1.2.3 HMT1基因的克隆及测序

将已获得的PCR产物与pGEM-T Easy载体于4 ℃条件下过夜连接，反应体系(10 μL)：回收产物3.5 μL，pGEM-T Easy载体1 μL，T4DNA连接酶1 μL，2×连接buffer 5 μL。连接产物转化至DH5α中，涂布在含有100 μg·mL-1氨苄青霉素(ampicillin，AMP)的LB固体培养基上过夜培养，挑取生长良好的单个白色菌落，划线并编号。利用T7、SP6通用引物进行菌落PCR，反应体系20 μL：模板用牙签蘸取少许菌，引物各0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，10×buffer 2 μL，dNTPs 1.6 μL，ddH2O 15.2 μL。PCR反应程序为95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，46 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环；72 ℃延伸10 min。利用1.0%琼脂糖凝胶电泳30 min筛选阳性克隆，挑选5个独立的阳性克隆，送至北京六合华大科技股份有限公司进行测序。

1.2.4 序列分析

采用NCBI网站的BLASTn工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在线比对测序得到的序列并判断其属性，同时在线搜索与其同源的核苷酸及氨基酸序列；将利用Vector NTI 10.0软件对测得的完整编码区序列进行蛋白质翻译及多序列比对等处理；利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)在线对蛋白理化性质进行预测；利用ScanProsite(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)在线对蛋白结构进行预测；利用Vector NTI 10.0和DNAMAN 8.0进行序列分析；利用MEGA 5.0构建系统演化树[3]。

1.2.5 重组表达载体的构建

根据已获得的目的基因序列及原核表达载体pET-30a-c(+)的多克隆位点序列设计一对含有酶切位点的引物BH1-F/HH1-R(BH1-F：5′-CGCGGATCCGCGATGGCCGGGGTGGTGGA -3′，划线处为BamHⅠ酶切位点；HH1-R：5′-CCCAAGCTTGGGTCACTGGCCGTTCCTGC TCTT-3′，划线处为HindⅢ酶切位点)。参照1.2.2和1.2.3的方法获得具有酶切位点的目的片段的单克隆菌株。扩大培养，提取质粒，用引物BH1-F/HH1-R对质粒进行 PCR扩增，扩增程序及体系参照引物H1-F/H1-R，进而获得大量含有酶切位点的目的片段。同时扩大培养带有pET-30a-c(+)载体的菌株，提取质粒。

将回收片段和pET-30a-c(+)载体同时进行37 ℃水浴30 min双酶切。体系为50 μL，包括10×Smart buffer 5 μL、BamHⅠ1 μL、HindⅢ1 μL、质粒或PCR回收产物小于1 μg，补ddH2O至50 μL。酶切后的目的条带和pET-30a-c(+)载体回收纯化后按3∶1的摩尔比混匀，加入2×连接buffer 5 μL及T4DNA连接酶1 μL后于4 ℃过夜连接。

将连接产物转化至DH5α中，以T7/T7 ter为引物，进行PCR扩增，筛选阳性克隆。PCR扩增程序参考引物T7/SP6，退火温度为58 ℃。挑选10个独立阳性克隆送至北京六合华大基因有限公司进行测序鉴定。

1.2.6 重组质粒的诱导表达

提取测序鉴定正确的阳性克隆菌株的质粒，转化至原核表达菌株BL21(DE3)，并过夜培养。取过夜培养的菌液100 μL接种于5 mL含100 mg·L-1卡纳霉素(kanamycin，Kana)的LB液体培养基，37 ℃、200 r·min-1振荡2 h左右，至OD600值为0.6～0.8，加入IPTG进行诱导表达。为了尽可能获得目的蛋白，设置不同IPTG终浓度：0、0.01、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mmol·L-1，震荡3 h后，分别收集诱导菌液于4 ℃ 保存备用。选择诱导蛋白质量最多的IPTG浓度作为IPTG诱导浓度，设置不同的诱导时间：1、2、3、4、5、6、8、10 h，分别收集诱导菌液于4 ℃保存备用。

1.2.7 重组蛋白的SDS-PAGE检测

将1.2.6中得到的菌液样品12 000 r·min-1离心5 min，弃上清，加入200 μL蛋白质提取液，沸水煮5 min，12 000 r·min-1离心3 min。取上清用10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电泳结束后进行考马斯亮蓝染色3 h，倒掉染色液，再用脱色液(冰乙酸：乙醇：水=1∶3∶6)脱色，检测蛋白质的表达情况。

2 结果与分析

2.1 四倍体小麦Langdon HMT1基因的克隆及其核酸序列分析

利用引物H1-F/H1-R对Langdon叶片cDNA进行PCR扩增，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，得到大小约为1 000 bp的特异性条带(图1)，与预期片段大小(975 bp)相符。将扩增产物回收、加A后连接到T载体，转入DH5α，获得阳性单克隆菌株后测序，结果显示，获得的目的片段长度为975 bp。与NCBI数据库公布的节节麦AS2407 HMT1基因 AetHMT1 相比，四倍体小麦Langdon的核苷酸序列发生了变化(图2)，克隆出两条不同的条带，与 AetHMT1的相似度极高，因此，其中一条命名为 LDNHMT1-1，另一条命名为 LDNHMT1-2。 LDNHMT1-1与 LDNHMT1-2的相似度高达95.6%， LDNHMT1-1与 AetHMT1的相似度高达95.1%， LDNHMT1-2与 AetHMT1的相似度高达96.4%，其中 LDNHMT1-1的核苷酸序列在54、84、93、108、189、201、225、232、240、244、282、294、296、300、306、331、333、335、336、339、357、363、366、381、387、393、399、402、423、426、429、441、494、501、588、591、636、639、684、702、744、751、840、843、846、871、906和948共48个位点与 AetHMT1不同。 LDNHMT1-2的核苷酸序列在84、106、108、120、189、225、232、244、252、363、366、372、393、402、423、429、441、445、447、494、498、547、567、577、591、636、639、661、702、840、843、846、855、906和934共35个位点与 AetHMT1不同。其中，Langdon两条序列都发生了变化的位点有84、108、189、225、232、244、363、366、393、402、423、429、441、494、591、636、639、702、840、843、846、906共22个，除366、402、494和906位点外，另外18个位点发生改变的结果一样。

M：核酸分子量标准；1和2：2次重复。

M:DNA marker; 1 and 2：Two replicates.

图1LangdonHMT1基因的PCR扩增结果

Fig.1PCRamplificationresultofHMT1geneinLangdon

2.2 四倍体小麦Langdon HMT1编码氨基酸序列的比较分析

根据已知的测序结果，对 LDNHMT1-1和 LDNHMT1-2进行翻译，然后与实验室前期获得的 AetHMT1预测结果进行比较，结果(图3)显示，核苷酸序列的变化导致氨基酸序列也发生了变化。LDNHMT1-1与 LDNHMT1-2的相似度高达95.6%，LDNHMT1-1与AetHMT1的相似度高达98.1%，LDNHMT1-2与AetHMT1的相似度高达98.1%。与AetHMT1相比，LDNHMT1-1氨基酸序列在99、112、165、248、251和316共6个位点上发生了变化，这是由7个氨基酸碱基变化导致的，说明41个核苷酸碱基的变化是同义突变，错义突变率为14.58%。而LDNHMT1-2在36、149、165、183、193和221共6个位点上发生了变化，这是由8个氨基酸碱基的变化引起的，说明27个核苷酸碱基的变化是同义突变，错义突变率为22.86%。且在165位点上两条序列均发生突变，且变异结果不一致。利用ProtParam对所得到氨基酸序列进行蛋白理化性质预测，结果可知， LDNHMT1-1、 LDNHMT1-2氨基酸的数量均为324，分子量分别为35.19和35.18 kDa；pI理论值分别为5.74和5.94。

目前，研究人员已经从其他物种中克隆出SMT和HMT，例如黄芪SMT(AbSMT)[17]、拟南芥HMT1(AtHMT1)[18]、羽衣甘蓝SMT(BoSMT)[12]、茶树SMT(CsSMT)[13]等。 LDNHMT1-1、LDNHMT1-2和其他甲基转移酶序列比对分析发现，LDNHMT1-1、LDNHMT1-2和其他SMT、HMT一样：C端附近有在锌链结构中扮演着重要的角色[19-21]的一个保守GGCCR序列和三个守恒的半胱氨酸残基：Cys236、Cys303、Cys304[18,22]，且都没有明显的叶绿体和线粒体靶向序列[22](图3)。

字体背景为黑色代表核苷酸碱基序列发生改变。

The nucleotide base mutations are shown with black background.

图2LDNHMT1-1、LDNHMT1-2和AetHMT1的核苷酸序列比对

Fig.2NucleotidesequencealignmentofLDNHMT1-1,LDNHMT1-2andAetHMT1

2.3 四倍体小麦Langdon HMT1的系统进化分析

通过进化树分析(图4)发现，LND HMT1-1、LND HMT1-2与节节麦HMT(AetHMT1)的相似度分别高达98.15%、98.50%，与黄芪SMT(AbSMT)的相似度分别高达49.70%、50.30%，与羽衣甘蓝SMT(BoSMT)的相似度分别高达52.31%、51.45%，与茶树SMT(CsSMT)的相似度分别高达49.86%、49.29%，与乌拉尔图小麦HMT1(TuHMT1)的相似度分别高达89.37%、92.24%，与拟南芥HMT1(AtHMT1)的相似度分别高达65.65%、65.65%，与玉米HMT1(ZmHMT1)的相似度分别高达87.04%、85.49%。

较高的同源性使得SMT与HMT具有共同促进半胱氨酸作用[23]，说明SMT和HMT可能源自一个共同的祖先，在功能上是相关的。HMT、SMT不同的保守氨基酸可能负责不同的酶催化能力[11]。

2.4 原核表达载体的构建和重组子的鉴定结果

利用引物BH1-F/HH1-R对Langdon叶片cDNA进行PCR扩增，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，均得到含有酶切位点、大小约为1 000 bp的特异性条带，分别将扩增产物回收、加A后连接到T载体进行测序，从Langdon克隆获得的质粒命名为pGEM-BH- LDNHMT1。BamHⅠ 和HindⅢ对pGEM-BH- LDNHMT1和pET-30a-c(+)分别双酶切并进行鉴定，酶切产物用1.0%的琼脂糖凝胶检测，结果显示，酶切后pET-30a-c(+)在5 000 bp附近出现一条亮带，而pGEM-BH- LDNHMT1则在1 000 bp处出现亮带(图5)。此外，连接重组后表达质粒的测序结果与克隆序列完全一致，Langdon同样得到两条序列，并且开放阅读框正确，因此，将获得的Langdon HMT1原核表达质粒分别命名为pET-BH-LDNHMT1-1和pET-BH- LDNHMT1-2。表明Langdon HMT1基因原核表达载体构建成功。

黑色背景表示序列保守；短线表示间断；单箭头表示第三个半胱氨酸残基；双箭头表示可能的Z链结构；红框代表LDNHMT1-1、LDNHMT1-2与AetHMT1相比，氨基酸发生变化的位点；AetHMT1、TuHMT1、AtHMT1、ZmHMT1分别代表节节麦、乌拉尔图小麦、拟南芥、玉米同型半胱氨酸甲基转移酶(EMT27714.1、EMS47619.1、AAF23821、AF297045)；CsSMT、BoSMT、AbSMT分别代表茶树、羽衣甘蓝、黄芪硒代半胱氨酸甲基转移酶(ABF47292.1、AY817737、CAA10368)。

Conserved residues are shaded in black;Stub depicting gaps were added for optimum alignment;The arrowhead indicates the third conserved Cys residue;The double-headed arrow shows the possible zinc-binding motif;The red frames indicate the changed amino acids of LDNHMT1-1 and LDNHMT1-2,compared with AetHMT1;AetHMT1,TuHMT1,AtHMT1 and ZmHMT1 represent HMT1s ofAegilopstauschiiCoss.(EMT27714.1),Triticumurartu(EMS47619.1),Arabidopsis(AAF23821) andZeamays(AF297045);CsSMT,BoSMT and AbSMT represent SMTs ofCamelliasinensis(ABF47292.1),Brassicaoleracea(AY817737) andA.bisulcatus(CAA10368).

图3LDNHMT1-1、LDNHMT1-2及其同源基因编码氨基酸序列的比对

Fig.3AlignmentofaminoacidsequencesencodedbyLDNHMT1-1,LDNHMT1-2andotherhomologousgenes

图4 LDNHMT1-1、LDNHMT1-2和其他相关物种蛋白质序列的进化树分析

M：核酸分子量标准；泳道1为Langdon HMT1基因双酶切后的结果；泳道2为pET-30a-c(+)双酶切后的结果。

M：DNA marker;1：The product of HMT1 gene in Langdon digested withBamHⅠ andHindⅢ; 2：The product of pET-30a-c(+) digested withBamHⅠ andHindⅢ.

图5LangdonHMT1基因和质粒pET-30a-c(+)的酶切鉴定结果

Fig.5TheproductsofHMT1inLangdonandpET-30a-c(+)digestedwithrestrictenzyme

2.5 目的蛋白的诱导表达

将测序正确的pET-BH- LDNHMT1-1转化至BL21(DE3)后，经不同浓度的IPTG和不同时间诱导表达，SDS-PAGE分析结果(图6)表明，重组质粒 pET-BH- LDNHMT1-1产生了一条约34 kDa的条带，与理论分子量大小相符；在200 r·min-1、37 ℃、3 h的培养条件下，目的蛋白的表达量在IPTG浓度为0.2 mmol·L-1时表达量最高；在200 r·min-1、37 ℃、IPTG 0.2 mmol·L-1的培养条件下，3 h后目的蛋白的表达量达到最高。说明 HMT1的最佳诱导条件为IPTG 浓度为0.2 mmol·L-1、诱导时间为3 h。同样，将测序正确的pET-BH- LDNHMT1-2转化至大肠杆菌BL21(DE3)后，经0.2 mmol·L-1IPTG诱导表达3 h，与LDNHMT1-1蛋白一起进行SDS-PAGE分析。结果(图7)表明，重组质粒pET-BH- LDNHMT1-2与pET-BH- LDNHMT1-1一样也产生了约34 kDa的条带，与理论分子量大小相符。

M：蛋白分子量标准；pET：空载体；A图泳道上方数字表示诱导浓度，单位为mmol·L-1；B图泳道上方数字表示诱导时间，单位为h；箭头所指为诱导的蛋白质。

M：Protein molecular weight marker; pET：The pET-30a-c(+) vector; The number above the lane in Figure 6A indicates the induction concentration(mmol·L-1) of IPTG; The number above the lane in Figure 6B indicates the induction time(h);Arrows indicate the induced proteins.

图6在不同诱导浓度(A)和诱导时间(B)下LDNHMT1-1基因原核表达产物的SDS-PAGE检测结果

Fig.6ExpressionoftheplasmidswithLDNHMT1-1withdifferentinductionconcentrations(A)anddifferentinductiontime(B)detectedbySDS-PAGE

3 讨 论

高浓度的硒对动植物具有毒害作用[24]，研究麦类作物的硒代谢，挖掘关键酶基因，培育或改良富硒作物具有重要的意义。硒代半胱氨酸甲基转移酶(SMT)是植物硒代谢途径中的一个关键酶，而同型半胱氨酸甲基转移酶(HMT)与SMT起源于同一祖先，具有类似的活性结构。目前，对于麦类作物富硒的关键酶基因研究较少。本研究以四倍体硬粒小麦Langdon为研究对象，克隆获得HMT1基因的ORF序列。核苷酸序列分析显示，Langdon中克隆出与 AetHMT1大小相同(975 bp)且序列发生变化的两条序列，其中一条命名为 LDNHMT1-1，另一条命名为 LDNHMT1-2。小麦是六倍体植物，包括A、B、D三个基因组[25]，节节麦是普通小麦D染色体组的供体[26]，Langdon是含有A、B染色体组的硬粒小麦[15]，三个基因组之间具有部分同源性。 LDNHMT1-1、 LDNHMT1-2基因克隆自Langdon(小麦A、B组染色体)，根据聚类分析结果， LDNHMT1-2与乌拉尔图小麦 HMT1(TuHMT1)在进化上的关系极近，而乌拉尔图小麦(Triticumurartu)是小麦属的二倍体种之一，是四倍体小麦和普通小麦A基因组的供体[27]， LDNHMT1-2很可能来自A染色体组，那么 LDNHMT1-1极有可能来自B染色体组。

M：蛋白分子量标准；1：空载体；2：LDNHMT1-1蛋白；3：LDNHMT1-2蛋白；箭头所指为诱导的蛋白质。

M：Protein molecular weight marker; 1：The pET-30a-c(+) vector; 2：Expressed protein of LDNHMT1-1; 3：Expressed protein of LDNHMT1-2; Arrow indicates the induced protein.

图7最佳诱导条件下LDNHMT1-1和LDNHMT1-2基因原核表达蛋白的SDS-PAGE检测结果

Fig.7ExpressionoftheplasmidswithLDNHMT1-1andLDNHMT1-2undertheoptimumconditiondetectedbySDS-PAGE

对 LDNHMT1-1、LDNHMT1-2所编码氨基酸进行分析发现，二者的氨基酸数量均为324，核苷酸的变化导致部分氨基酸序列也会发生变化，进而分子量也发生了变化，分子量分别为35.19、35.18 kDa。它们和其他相关SMT、HMT一样，C端附近有在锌链结构中扮演着重要的角色[19-21]的一个保守的GGCCR序列和三个守恒的半胱氨酸残基：Cys236、Cys303、Cys304[19,24]，且都没有明显的叶绿体和线粒体靶向序列[22]。进一步通过进化树分析发现，LNDHMT1-1、LNDHMT1-2和SMT具有较高的同源性，有共同促进半胱氨酸作用[23]，SMT和HMT可能来自同一个祖先，在功能上是相关的。HMT、SMT不同的保守氨基酸可能负责不同的酶催化能力[11]。LNDHMT1-1和LNDHMT1-2酶催化能力是否也是如此，有待进一步考证。

将构建成功的含有 LNDHMT1-1和 LNDHMT1-2的重组质粒转入大肠杆菌 BL21(DE3)后，经不同浓度的IPTG 和不同时间诱导表达，确定最佳诱导表达条件为：IPTG浓度为0.2 mmol·L-1，诱导时间为3 h，最终得到Langdon的两种HMTI蛋白质。然而，Langdon HMT1蛋白质是否具有活性、酶活大小以及与硒吸收的关系，还有待于进一步运用分子生物学手段等进行研究。

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CloningandProkaryoticExpressionAnalysisofHMT1GeneinTetraploidWheatLangdon

WULijun1,2,SHANGYue1,2,LIUTao1,2,CHENWenjie1,3,LIUBaolong1,3,ZHANGLianquan4,LIUDengcai4,ZHANGBo1,3,ZHANGHuaigang1,3
(1.Northwest Institute of Plateau Biology,Chinese Academy of Sciences,Xining,Qinghai 810001,China; 2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China; 3.Qinghai Province Key Laboratory of Crop Molecular Breeding,Xining,Qinghai 810008,China; 4.Triticeae Research Institute,Sichuan Agricultural University,Chengdu,Sichuan 611130,China)

时间：2017-09-13

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170913.1138.002.html

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)09-1139-09

2017-03-03

2017-07-01

国家自然科学基金项目(31101140)；中国科学院战略性A类先导科技专项子课题(XDA08030106)；中国科学院西部之光一般项目；青海省重点研发与转化计划项目(2016-HZ-808)；青海省高原作物种质资源创新与利用国家重点实验室培育基地开放课题(2014-09)

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张 波(E-mail:zhangbo@nwipb.cas.cn)；张怀刚(E-mail:hgzhang@nwipb.cas.cn)