羟基多溴代二苯醚与甲状腺素运载蛋白相互作用的3D-QSAR研究

梁峰，穆云松，李会仙，冯承莲

1. 河南城建学院 市政与环境工程学院，平顶山 4670362. 中国环境科学研究院 环境基准与风险评估国家重点实验室，北京 100012

羟基多溴代二苯醚与甲状腺素运载蛋白相互作用的3D-QSAR研究

梁峰1，穆云松2,*，李会仙2，冯承莲2

1. 河南城建学院 市政与环境工程学院，平顶山 4670362. 中国环境科学研究院 环境基准与风险评估国家重点实验室，北京 100012

近年来，羟基多溴代二苯醚(OH-PBDEs)的类甲状腺素效应逐渐引起人们的关注，然而其结构效应关系和致毒机制尚不清楚。甲状腺激素结合球蛋白(TBG)和运甲状腺素蛋白(TTR)是人体转运甲状腺素的重要蛋白，通过计算毒理学手段可以揭示OH-PBDEs的微观毒理机制。利用分子对接技术研究OH-PBDEs与TBG、TTR的结合模式和构象特征，识别关键氢键氨基酸为赖氨酸Lys270(TBG)，亮氨酸Leu110(TTR)和丝氨酸Ser117(TTR)。基于活性构象特征，构建14种典型OH-PBDEs的3D-QSAR模型，定量预测OH-PBDEs与TBG、TTR的结合亲和力。最佳预测模型的相关系数r2分别为0.966(TBG)和0.961(TTR)，抽一法交叉验证相关系数q2分别为0.560(TBG)和0.525(TTR)。研究发现，OH-PBDEs的静电和氢键作用可增强结合亲和力，分别贡献65.4%(TBG)和68.7%(TTR)。研究结果为揭示OH-PBDEs与甲状腺素转运蛋白的相互作用提供新视角，有助于全面评价OH-PBDEs对人体甲状腺素调节功能的损伤。

羟基多溴代二苯醚；甲状腺素结合球蛋白；运甲状腺素蛋白；竞争抑制；比较分子场分析；比较相似性指数分析

Received5 December 2016accepted23 January 2017

Abstract: Hydroxylated polybrominated diphenyl ethers (OH-PBDEs) is a kind of emerging persistent organic pollutants that may interfere with regulating function of human thyroid hormone; however, the molecular mechanism behind remains unknown. In the present study, molecular docking was performed to explore the possible inhibition activity of OH-PBDEs to thyroxine-binding globulin (TBG) and transthyretin (TTR). Hydrogen bonding interaction was found to enhance the binding affinity of OH-PBDEs to these proteins through critical hydrogen bond amino acids of Lys270 (TBG), Leu110 (TTR) and Ser117 (TTR). Based on stimulated binding modes, the 3D-QSAR model on 14 OH-PBDEs, triiodothyronine (T3) and tyroxine (T4) was developed to predict binding affinities of OH-PBDEs to TBG and TTR. The optimal models from comparative molecular similarity index analysis (CoMSIA) were developed with r2value of 0.966 (TBG) and 0.961 (TTR), and q2value of 0.560 (TBG) and 0.525 (TTR). Electrostatic and hydrophobic field of OH-PBDEs account for 72% (TBG) and 68% (TTR) of binding affinities, respectively. These findings provide new insight into OH-PBDEs-TBG/TTR interactions, and will be conducive to evaluating damage of this type of chemicals to human health.

Keywords: OH-PBDEs; thyroxine-binding globulin; transthyretin; competitive inhibition; comparative molecular field analysis; comparative molecular similarity index analysis

多溴二苯醚(polybrominated diphenyl ethers，简称PBDEs)凭借优异的阻燃性能在世界范围内被广泛使用。然而，因其具有一定的毒性作用和内分泌干扰效应，加上巨大的产量和稳定的化学性质，成为近年来备受关注的持久性有机污染物。特别是在婴幼儿体内PBDEs的含量高于成人，其神经发育毒性成为近年来环境毒理学的研究热点[1]。目前，唯一获得生产许可的PBDEs为全溴代同系物BDE-209，与其他PBDEs相比具有较低的甲状腺素干扰水平，然而其代谢产物的毒性效应不容忽视[2]。这些代谢产物在各种环境介质中都有检出，包括土壤、空气、水体、沉积物、鱼类、鸟类、哺乳动物和人体中[3-6]。在人体的组织和血液检出的PBDEs代谢产物主要包括四溴代二苯醚，五溴代二苯醚，六溴代二苯醚以及羟基化代谢产物[7]。对于一些特定的终点，羟基多溴代二苯醚(OH-PBDEs)表现出更高的毒性效应[8]。

甲状腺素对生物体正常生长发育至关重要，溴代阻燃剂通过干扰甲状腺素平衡导致北极海鸟幼体发育迟缓[9]。大量研究证实，PBDEs的体内代谢产物OH-PBDEs可导致血清中三碘甲状腺原氨酸(T3)和四碘甲状腺原氨酸(T4)水平降低[10-11]。它们是调节细胞代谢速率的重要化学成分，浓度降低对啮齿类动物的发育和行为影响造成不良影响[12]。研究发现，外源污染物主要通过影响甲状腺素的正常代谢和转运干扰甲状腺系统功能[13]。在人体血浆中，甲状腺素结合球蛋白(thyroid-binding globulin，简称TBG)和运甲状腺素蛋白(transthyretin，简称TTR)是2种最主要的甲状腺素转运蛋白，分别转运75%和20%的甲状腺素[14]。由于OH-PBDEs与T4的化学结构相似，已被证实可通过与内源激素竞争结合甲状腺素转运蛋白而干扰机体的正常激素调节机能[13, 15]。Meert等[16]以碘同位素标记的T4研究了OH-PBDEs与TTR的体外竞争结合，结果显示，3种OH-PBDEs与人类TTR具有很高的结合能力，而PBDEs对T4-TTR结合无影响。Hamers等[17]发现小鼠肝脏细胞中BDE-47的6种代谢产物比T4具有更高的结合亲和力，其中3-OH-BDE-47活性最高。

目前，动物实验是了解化学物质潜在甲状腺素干扰效应的主要途径。然而，出于伦理，经济和可操作性的原因，不可能逐一测定所有潜在活性化学物。另外，动物实验通常不能提供致毒机理信息，导致测定结果不能外推到其他物种。对于特定生命期或者生物需要通过调控甲状腺素水平来适应环境的情况，通过实验测定相关效应更加困难。因此，采用体外实验和计算机模拟相结合，定量识别甲状腺素干扰效应尤为重要[18]。目前，关于OH-PBDEs与甲状腺素转运蛋白相互作用机理的研究非常有限，考虑到环境暴露和人体代谢的复杂性，了解更多结构类型OH-PBDEs与人类甲状腺素转运蛋白的微观分子机制尤为重要。Legler等[19]通过研究发现，溴原子数量，取代位点和氢键作用是OH-PBDEs与甲状腺素转运蛋白结合的主要贡献因子。易忠胜等[20]采用基于预测的变量筛选和建模方法构建了OH-PBDEs与甲状腺素运载蛋白结合能力的线性预测模型，证明溴原子数量和取代位置对OH-PBDEs生物活性具有重要影响。Cao等[21]采用logKow构建了非线性预测模型，用于表征OH-PBDEs对2种甲状腺素运载蛋白的干扰效应，提出了丝氨酸是TBG的关键氢键结合位点。Yang等[22]尝试构建3D-QSAR模型预测PBDEs和OH-PBDEs对TTR的抑制活性。Yang等[23-24]基于分子模拟结果，选取16种分子描述符定量评估卤代酚类化合物与TTR的干扰效应，并比较了离子态和分子态卤代酚类化合物的作用模式差异。本研究在已有研究基础上，旨在借助柔性分子对接和3D-QSAR建模手段，揭示OH-PBDEs与TBG、TTR的微观结合模式差异，最终构建基于OH-PBDEs活性构象3D-QSAR预测模型，作为实验室毒性试验的有益补充。特别是在OH-PBDEs的危害评估中，可以在很大程度上突破基础毒性数据不足的瓶颈。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 模拟数据集

选取甲状腺素T3、T4和14种OH-PBDEs作为研究对象，活性数据来源于荧光置换法测定的结合常数K[21]。OH-PBDEs与甲状腺素转运蛋白的结合常数遵循Hansch方程。OH-PBDEs初始建模结构来自于剑桥晶体结构数据库，利用Tripos力场对所有化合物进行分子力学优化，迭代次数设为10 000。价电子采用Gasteiger+Huckel力场优化，收敛限为0.05 kcal·mol-1，其他参数均采用缺省值。优化得到的最低能量构象作为配体分子的初始低能稳定构型。利用SYBYLX1.0软件构建所有化合物的三维结构模型。选择人类T4/TBG复合物(PDB ID: 2CEO)[25]和T4/TTR复合物(PDB ID: 1ICT)[26]的晶体结构作为甲状腺素转运蛋白的三维结构(http://www.rcsb.org/pdb)。在中性条件(pH=7)下，对蛋白结构加氢和加电荷后利用MOLCAD程序确定靶蛋白的活性口袋，将晶体结构中天然配体所在位置周围6.5 Å范围定义为蛋白结合活性位点。

1.2 分子对接和3D-QSAR模型构建

采用Surflex-Dock分子对接程序将T3、T4和14种OH-PBDEs分别对接入TBG和TTR的活性位点。分子对接过程如下：将晶体结构中的天然配体提取出来，采用Biopolymer程序去除水分子并增加氢原子；为蛋白质分子增加Kollman原子电荷，其他参数采用缺失值；基于“锁匙原理”，配体和甲状腺素转运蛋白的对接结合能作为评价分子对接结果的主要指标，Surflex-Dock的打分函数包括疏水性、极性、排斥作用、熵和溶剂化效应等，总打分值(Total Score，简称TS)用于估算配体受体的结合常数(K)。

将配体-受体复合物体系能量最低的配体构象作为低能活性构象，以最大公共子结构进行分子叠合。将叠合好的分子置于一个三维网格中，格点间距离为2 Å。sp3杂化碳原子作为分子探针，探针半径1 Å，带+1价电荷，计算分子在每个网格点上的立体场、静电场、疏水场、氢键给体场和氢键受体场，其他都采用缺省值。柱过滤设置为1.0 kcal·mol-1是为了提高分析速度和降低噪声，能量阈值均为126 kJ·mol-1。

1.3 数据统计分析

以比较分子场分析(CoMFA)和比较分子相似性指数(CoMSIA)方法计算的力场参数作为自变量，配体-受体结合常数(-logK)为因变量，利用偏最小二乘法(PLS)建立3D-QSAR模型。最佳主成分数通过抽一法进行交叉验证过程确定。模型统计学指标包括相关系数(r)、标准偏差(SE)、F值、交叉验证相关系数(q2)和预测标准误差(RMSEcv)由公式1和公式2计算。

(1)

(2)

2 结果(Results)

2.1 OH-PBDEs与甲状腺素转运蛋白的结合模式

基于天然配体T3和T4的构象，对TBG和TTR的活性位点进行识别。将晶体结构(PDB ID: 2CEO)中的T4提取出来，然后重新对接入TBG的活性位点，均方根偏差(RMSD)为0.2 Å，结合模式见图1(a)。T4位于TBG的浅表型活性位点中，并分别与赖氨酸Lys270，天冬酰胺Asn273和精氨酸Arg378形成稳定的氢键网络，表现出很强的结合亲合力。活性位点内部具有很强的疏水狭长凹槽，使T4的2个苯环嵌入其中。分子对接得到的结合模式与晶体结构信息一致。虽然T3与T4的结合位点相同，T3的结合模式与T4存在差异，形成氢键的关键氨基酸为天冬酰胺Asn273和精氨酸Arg378(图1(b))。由于T3比T4少一个碘原子取代基，导致T3两苯环的二面角大于T4，结合能低于T4。

TTR晶体结构(PDB ID: 1ICT)的天然共结晶配体为T4。结合模式见1(c)，T4位于四聚体TTR结合所形成的疏水通道中，并分别与2个蛋白单体的赖氨酸Lys15和丝氨酸Ser117形成稳定的氢键网络，表现出很强的结合亲合力。活性位点内部具有很强的疏水狭长凹槽，使T4的2个苯环嵌入其中。图中红色分子为晶体结构中T4的构象，彩色分子为分子对接得到的T4构象，两者的RMSD值小于0.5 Å。T3与TTR的结合模式见图1(d)，结合位点和关键氨基酸与T4相同。

图2 14种OH-PBDEs与TBG(a)、TTR(b)的结合模式注：TBG和TTR三维结构用飘带结构表示，对接配体用棍状模型表示，活性位点的疏水性质用MOLCAD彩色表面描述，氢键以黄色虚线表示。Fig. 2 Binding modes of 14 OH-PBDEs with TBG (a) and TTR (b)Note: 3D structures of TBG and TTR were expressed as ribbon structures, docked ligands were expressed as stick model, hydrophobic properties of the active sites were produced by the MOLCAD programme, and hydrogen bond were expressed as yellow dotted lines.

14种OH-PBDEs与TBG、TTR的分子对接结果见图2。OH-PBDEs的羟基取代基通过与TBG的赖氨酸Lys270形成氢键而表现出较强的结合亲合力。TTR的活性口袋由于是二聚体共同形成，因此活性位点的氨基酸具有对称特征，形成氢键的关键氨基酸为丝氨酸Ser117和络氨酸Leu110。但是，TTR的活性口袋比TBG更加开放，空腔体积更大，OH-PBDEs与TTR结合的空间取向更丰富。

所有化合物的对接分值见表1，T4、T3与TBG的对接结合能高于OH-PBDEs，但4-羟基-2,2’,3,4’-四溴二苯醚、4’-羟基-2,2’,4-三溴二苯醚、4’-羟基-2,2’,4,5’-四溴二苯醚等化合物与T3处于同一数量级。说明OH-PBDEs可以和T3、T4竞争结合TBG，进而干扰体内正常甲状腺激素调节功能。通过比较OH-PBDEs与TTR的对接结合能，发现OH-PBDEs与T3、T4的结合能力更为接近，2’-羟基-4-溴二苯醚、2’-羟基-2,3’,4,5’-四溴二苯醚和6-羟基-2,2’,3,4,4’-五溴二苯醚的结合能力强于T3和T4。

表1 OH-PBDEs与TBG、TTR的对接结合能Table 1 Binding constants (K) and docking affinity (Total Score, TS) of fourteen OH-PBDEs with TTR and TBG obtained from the fluorescence displacement measurements

2.2 OH-PBDEs的分子叠合与3D-QSAR模型

T4、T3和14种OH-PBDEs的对接活性构象采用最大公共子结构进行叠合(图3)。OH-PBDEs的2个苯环中心和疏水中心重合。

随机选取3个化合物，3'-羟基-2,4-二溴二苯醚、3'-羟基-2,4,4'-三溴二苯醚和2'-羟基-2,4,4'-三溴二苯醚为外部验证集，分别构建TBG和TTR结合常数的3D-QSAR预测模型。最佳模型的统计学参数和各个模型的力场贡献值见表2。CoMFA模型的抽一法交叉验证相关系数q2分别为0.270(TBG)和0.317(TTR)，最佳主成分数分别为5(TBG)和4(TTR)，非交叉验证相关系数r2为0.967。CoMSIA模型的抽一法交叉验证相关系数q2分别为0.560(TBG)和0.525(TTR)，最佳主成分数为5，非交叉验证相关系数r2分别为0.966(TBG)和0.961(TTR)。

3D-QSAR模型预测能力见图4。图中红色数据点为CoMFA模型的预测值，蓝色数据点为CoMSIA模型的预测值，TBG预测集的结合常数范围在7.5～8.5之间，TTR预测集的结合常数范围在7.0～8.25之间。依据Topliss与Costello原则，多元线性QSAR模型结构描述符与训练集样本最小数目是1:5[27]，可见模型的主成分数偏大，采用Golbraikh等[28]提出的方法评价预测值和实验值的一致性。TBG-CoMSIA模型一致性参数为R02=0.8871，R0’2=0.9572，k=1.0057，k’=0.9942；TTR-CoMSIA模型一致性参数为R02=0.9946，R0’2=0.9935，k=1.0034，k’=0.9966。根据判定规则：模型的q2>0.5，R2>0.6，R02或R0’2接近R2，k值和k’值介于0.85与1.15之间，证明CoMSIA模型具有良好的预测能力。

图3 T3、T4和14种OH-PBDEs的分子叠合图Fig. 3 Molecular alignment of 14 OH-PBDEs, T3 and T4

图4 观测结合常数与模型预测值的比较Fig. 4 Observed vs. predicted binding constant (-logK) obtained from the CoMFA and CoMSIA model

表2 CoMFA和CoMSIA的统计学结果和力场贡献Table 2 CoMFA and CoMSIA model to predict binding constant of TBG and TTR

3 讨论(Discussion)

OH-PBDEs与内源甲状腺素T3或T4具有相近的分子结构特征，包括二苯醚骨架结构，多卤素取代和苯环上的羟基取代位点，决定了OH-PBDEs对甲状腺素蛋白具有潜在的抑制效应。由于14种OH-PBDEs的溴原子数量和取代位不同，导致与TBG和TTR的结合模式存在差异。分子对接结果可有效识别出OH-PBDEs的结合位点和发生氢键相互作用的关键氨基酸残基。对比TBG和TTR的活性位点特征，TBG属于浅表性活性口袋，T4分子中的氨基丙酸取代基可通过构象回折形成氢键[25]。OH-PBDEs无氨基丙酸取代基，因此复合物的稳定性降低，分子对接结果也证明OH-PBDEs与TBG的对接结合能不及T4。TTR的活性位点是四聚体结构形成的疏水性通道中，T4分子中的一个苯环深埋入疏水性口袋底部，与丝氨酸Ser117的氢键作用增加了复合物的稳定性。TTR的多聚体结构有助于了OH-PBDEs的稳定结合。通过对TBG和TTR活性位点的特征分析不难发现，各OH-PBDEs的二苯醚骨架在活性位点中的空间取向相近，静电作用和氢键结合位点决定了结合能的强弱。同时，OH-PBDEs与通过竞争结合T3或T4干扰甲状腺素的调节作用。

图5 TBG-CoMSIA的三维等值线图注：立体场(a)，静电场(b)，疏水场(c)，氢键给体和受体(d)。模型绿色和黄色色块分别代表立体场的正贡献和负贡献，蓝色和红色色块分别 代表静电场的正贡献和负贡献，黄色和白色色块分别代表疏水场的正贡献和负贡献，青色和紫色色块分别代表氢键给 体场的正贡献和负贡献，紫红色和红色色块分别代表氢键受体场的正贡献和负贡献。Fig. 5 3D contour plots from TBG-CoMSIA analysisNote: Steric contour plots (a), green contours indicate regions where bulky groups increase activity, whereas yellow contours indicate regions where bulky groups decrease activity; Electrostatic contour plots (b), blue contours indicate regions where positive groups increase activity, whereas red contours indicate regions where negative charge increases activity; Hydrophobic contour plots (c), yellow contours indicate regions where hydrophobic groups increase activity, whereas white contours indicate regions where hydrophobic groups decrease activity; H-bond donor and acceptor contour map (d), cyan contours indicate regions where hydrogen-bond donor groups on the receptor increase activity, whereas purple contours indicate regions where hydrogen-bond donor groups on the receptor decrease activity; magenta contours indicate regions where hydrogen-bond acceptor groups on the receptor increase activity, whereas red contours indicate regions where hydrogen-bond acceptor groups on the receptor decrease activity.

尽管前人建立了预测OH-PBDEs甲状腺素效应的线性和非线性模型，但仍需要进一步完善。易忠胜等[20]采用Dragon软件计算14种OH-PBDEs结构描述符，构建生物活性的线性预测模型。模型具有良好的稳健性和拟合能力。不足之处在于线性模型自由度过大，并且无验证集。Cao等[21]利用OH-PBDEs的理化性质log Kow预测毒性效应，仅从模型中无法获得OH-PBDEs结构特征和结合模式的信息。Yang等[22]提出的CoMSIA模型预测PBDEs和OH-PBDEs对TTR的抑制活性，没有涉及OH-PBDEs与2种甲状腺素转运蛋白的结合模式差异。综合考虑，本文提出的3D-QSAR不仅可以获得较好的模型稳健性，同时可获得OH-PBDEs不同取代基对抑制甲状腺素转运蛋白活性的贡献。模型的不足之处在于，与2D-QSAR模型相比，3D-QSAR模型需要分子叠合，特别是基于分子对接的活性构象，在一定程度上削弱了模型的易用性。

比较CoMFA和CoMSIA模型的预测结果，CoMSIA模型具有较高的r2和q2值，比CoMFA模型稳健。CoMFA模型的立体场贡献分别为59.1%(TBG)和62.2%(TTR)，而CoMSIA模型的静电场贡献降低为40.2%(TBG)和39.4%(TTR)，而模型对OH-PBDEs氢键作用的识别能力更强，分别贡献25.2%和29.3%。预测TBG结合常数的CoMSIA模型三维等值线图如图5所示，OH-PBDEs分子周围引入静电基团以及C4取代位上引入氢键给体基团和醚氧原子周围引入氢键受体取代基团有助于亲合力的提高。

如图6所示，TTR-CoMSIA的等值线图中OH-PBDEs周围引入空间大位阻基团有利于TTR结合力提高。OH-PBDEs分子周围引入静电基团以及C4取代位上引入氢键给体基团和醚氧原子周围引入氢键受体取代基团有助于亲合力的提高。在与TTR结合过程中，氢键给体取代基团的贡献大于与TBG结合的贡献。

综上所述，本研究采用分子对接和3D-QSAR技术，构建了14种典型OH-PBDEs的类甲状腺素活性预测模型。研究表明，持久性有机污染物PBDEs的代谢产物OH-PBDEs通过与甲状腺素转运蛋白TBG和TTR竞争结合干扰人体甲状腺素系统的正常生理功能。OH-PBDEs的羟基取代基通过氢键作用与TBG、TTR结合，不同溴取代基的数量和取代位点影响蛋白结合亲和力。研究方法可应用于评价其他卤代污染物代谢产物的人体甲状腺素功能损伤。

图6 TTR-CoMSIA的三维等值线图注：立体场(a)，静电场(b)，疏水场(c)，氢键给体和受体(d)。Fig. 6 3D contour plots from TTR-CoMSIA analysisNote: Steric contour plots (a), Electrostatic contour plots (b), Hydrophobic contour plots (c), and H-bond donor and acceptor contour map (d).

致谢：感谢上海源资公司周梅女士提供计算机模拟软件支持。

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3D-QSARStudyonInteractionsbetweenHydroxylatedPBDEsandThyroidHormonesTransportProteins

Liang Feng1, Mu Yunsong2,*, Li Huixian2, Feng Chenglian2

1. School of Municipal and Environmental Engineering, Henan University of Urban Construction, Pingdingshan 467036, China2. State Key Laboratory of Environmental Criteria and Risk Assessment, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China

10.7524/AJE.1673-5897.20161205001

2016-12-05录用日期2017-01-23

1673-5897(2017)3-251-10

X171.5

A

穆云松(1982-)，男，环境化学博士，副研究员，主要研究方向为环境化学和预测毒理学，发表学术论文30余篇。

国家自然科学基金面上项目(41673087)；河南省科技攻关计划项目(162102310389) ；河南省教育厅科学技术研究重点项目(14A610012)

梁峰(1973-)，男，讲师，研究方向为环境污染物的构效关系研究，E-mail: liangfeng@hncj.edu.cn；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: muys@craes.org.cn

梁峰, 穆云松, 李会仙, 等. 羟基多溴代二苯醚与甲状腺素运载蛋白相互作用的3D-QSAR研究[J]. 生态毒理学报，2017, 12(3): 251-260

Liang F, Mu Y S, Li H X, et al. 3D-QSAR study on interactions between hydroxylated PBDEs and thyroid hormones transport proteins [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 251-260 (in Chinese)