新型芳基修饰的尿苷型荧光探针的合成及其性能

翟文姬, 张肖肖, 洪建权, 郑昌戈

(江南大学 化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122)

·研究论文·

新型芳基修饰的尿苷型荧光探针的合成及其性能

翟文姬, 张肖肖, 洪建权, 郑昌戈*

(江南大学 化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122)

4-氟苯乙酮经二氧化硒氧化得到4-氟苯甲酰甲酸(1);1与盐酸氨基脲在碱性条件下经环合反应制得5-(4-氟苯基)-6-氮杂嘧啶(2);2与1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-1-β-D-呋喃核糖在无水乙腈中反应得2′,3′,5′-三苯甲酰氧基-5-(4-氟苯基)-6-氮杂尿苷(3);3在甲醇中水解合成了一种新型荧光核苷探针——5-(4-氟苯基)-6-氮杂尿苷(4)，其结构经1H NMR,13C NMR和MS(ESI)表征。并研究了4的性能。结果表明：4在水中的量子产率高达0.81，对极性变化敏感；4可选择性识别Pd2+，在5.0×10-7～5.0×10-6mol·L-1能定量检测Pd2+。

5-(4-氟苯基)-6-氮杂尿苷; 荧光探针; 合成; 离子识别; 荧光性能

Abstract： 4-Fluorobenzoylformic acid(1) was prepared by oxidation reaction of 4-fluoroacetophenone with selenium dioxide. Cyclization of1with semicarbazide hydrochloride under alkaline conditions gave 5-(4-fluorophenyl)-6-aza uracil(2). 5-(4-fluorophenyl)-6-aza-2′,3′,5′-tribenzoyl-uridine(3) was obtained by the reaction of2with 1-O-acetyl-2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D-ribofuranose in anhydrous acetonitrile. A novel fluorescent nucleoside probe, 5-(4-fluorophenyl)-6-aza uridine(4), was synthesized by hydrolysis of3in methanol. The structure was characterized by1H NMR,13C NMR and MS(ESI). In addition, the properties of4were also investigated. The results showed that the quantum yield of4was up to 0.81 in water and it was very sensitive to environmental polarity. A study of the recognition effect of4for different metal cations was carried out. The result indicated that4exhibited good selectivity toward Pd2+in the range of 5.0×10-7～5.0×10-6mol·L-1.

Keywords： 5-(4-fluorophenyl)-6-aza uridine; fluorescence probe; synthesis; ion recognition; fluorescent property

荧光探针广泛应用于光学材料、化学传感以及生物医药等领域。荧光光谱检测的可靠性和灵敏度取决于荧光探针的特性。随着生物科学的发展和各学科间的交叉渗透，制备低毒性、高量子产率及高灵敏度的荧光探针，成为人们研究的热点。

Scheme1

核苷是DNA与RNA的基本组成单元，可以作为生物探针的良好骨架[1]。通过对碱基结构的化学修饰(如扩大π键共轭[2-4]、融合芳香杂环[5-7]),可赋予核苷良好的光物理性质。苯环是最常见的芳香基团，具有较大的平面共轭结构，能有效延伸碱基的共轭体系，有利于荧光发射。此外，在嘧啶6-位引入氮原子，可进一步增强“推-拉”电子极化效应，使发射波长红移至可见光区并提高对环境的敏感性。

与荧光染料及大分子荧光探针相比，以天然核苷为模板修饰的荧光探针具有良好的发射性、生物兼容性和敏感性[8-10]。目前，核苷类荧光探针主要应用于生物和医药领域，在金属离子识别方面的研究较少。因此开发新型荧光核苷探针，探究其对环境或生物体内金属离子的识别能力，有利于扩大荧光核苷探针的应用范围。

钯是一种不能被自然降解的金属。残留在土壤、水质中的痕量钯，可通过生物富集进入人体。研究表明，人体中钯的过量积累会导致线粒体和DNA发生一定程度的降解，抑制酶的活性，造成细胞功能障碍[11]。因此，开发一种选择性好、毒性低的检测钯的方法具有较高的实际意义。

本文以4-氟苯乙酮为原料，经二氧化硒氧化得到4-氟苯甲酰甲酸(1);1与盐酸氨基脲在碱性条件下经环合反应制得5-(4-氟苯基)-6-氮杂嘧啶(2);2与1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-1-β-D-呋喃核糖在无水乙腈中反应得2′,3′,5′-三苯甲酰氧基-5-(4-氟苯基)-6-氮杂尿苷(3);3在甲醇中水解合成了一种新型荧光核苷探针——5-(4-氟苯基)-6-氮杂尿苷(4, Scheme 1)，其结构经1H NMR,13C NMR和MS(ESI)表征。并研究了4的性能。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TU-1901型双光束紫外可见分光光度计；CARY Eclipse荧光分光光度计；Bruker AVANCE 400 MHz型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)；LCMS-2010EV型质谱仪。

1按文献[12]方法合成；其余所用试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。

1.2 合成

(1)2的合成

在100 mL圆底烧瓶中依次加入1504.4 mg(3 mmol)，盐酸氨基脲401.5 mg(3.6 mmol)和去离子水30 mL，搅拌下于60 ℃反应18 h。滴加2 mol·L-1NaOH溶液12 mL，反应4 h。用浓盐酸调至pH 4，析出白色沉淀，抽滤，滤饼干燥得白色固体2447.5 mg，产率72%;1H NMRδ: 12.51(s, 1H, NH), 12.11(s, 1H, NH), 7.93(dd,J=8.8 Hz, 5.7 Hz, 2H, ArH), 7.28(t,J=8.9 Hz, 2H, ArH);13C NMRδ:164.41, 161.95, 157.22, 149.69, 140.72, 130.69, 129.36, 115.58, 115.36。

(2)3的合成

氮气保护下，在三口烧瓶中加入2207.2 mg(1 mmol),N,O-双三甲硅基乙酰胺(BSA)0.76 mL(3 mmol)和无水乙腈40 mL，搅拌使其混合均匀；依次加入1-乙酰氧基-2,3,5-三苯甲酰氧基-1-β-D-呋喃核糖570.1 mg(1.1 mmol)和三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf)0.2 mL(1 mmol)，于85 ℃反应2 h(TLC跟踪)。减压蒸除溶剂，残余物加入乙酸乙酯20 mL，依次用去离子水(3×15 mL)和饱和NaCl溶液(3×15 mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，蒸干后经硅胶柱层析[洗脱剂：A=V(二氯甲烷)/V(甲醇)=80/1]纯化得白色泡沫状固体3540.8 mg，产率83%;1H NMRδ: 12.52(s, 1H, NH), 8.04(dd,J=8.5 Hz, 5.8 Hz, 2H, ArH), 7.95(d,J=7.9 Hz, 2H, ArH), 7.88(dd,J=7.2 Hz, 5.6 Hz, 4H, ArH), 7.70～7.63(m, 2H, ArH), 7.58(t,J=7.4 Hz, 1H, ArH), 7.47(dt,J=20.4 Hz, 7.7 Hz, 4H, ArH), 7.31(t,J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.24(t,J=8.9 Hz, 2H, ArH), 6.54(d,J=2.8 Hz, 1H, CH), 6.01～6.16(m, 2H, CH2), 4.87～ 4.82(m, 1H, CH), 4.68(dd,J=12.2 Hz, 3.3 Hz, 1H, CH), 4.57(dd,J=12.3 Hz, 4.5 Hz, 1H, CH)。

(3)4的合成

在100 mL耐压管中加入3521.3 mg(0.8 mmol)和甲醇40 mL，搅拌下通入氨气至固体完全溶解；密封后于60 ℃反应过夜(TLC跟踪)。蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂：A=20/1)纯化得白色固体4257.9 mg，产率95%;1H NMRδ: 12.37(s, 1H, NH), 8.03～7.94(m, 2H, ArH), 7.37～7.27(m, 2H, ArH), 6.02(d,J=3.2 Hz, 1H, CH), 5.31(d,J=5.0 Hz, 1H, OH), 5.04(d,J=6.1 Hz, 1H, OH), 4.67(t,J=5.9 Hz, 1H, OH), 4.32(dd,J=8.3 Hz, 4.9 Hz, 1H, CH), 4.19(dd,J=11.1 Hz, 5.7 Hz, 1H, CH), 3.84(dd,J=9.7 Hz, 5.2 Hz, 1H, CH), 3.61～3.56(m, 1H, CH), 3.51～3.36(m, 1H, CH);13C NMRδ: 164.69, 162.23, 156.53, 149.04, 141.27, 131.06, 129.08, 115.75, 115.54, 90.01, 85.02, 73.34, 70.66, 62.01; MS(ESI)m/z: 340{[M+H]+}。

2 结果与讨论

2.1 光学性能

(1) UV-Vis

图1为4在不同溶剂中的UV-Vis谱图。由图1可见，4的紫外吸收峰位于近紫外区，这是由n→π*电子跃迁所产生的。4在二氧六环中的最大吸收波长为303 nm，在水溶液中的最大吸收波长为295 nm。这是因为碱基中的杂原子含有孤对电子，在极性溶剂中容易形成氢键，跃迁时需要一定的附加能量破坏氢键。因此随着溶剂极性的增大，最大吸收波长出现微小蓝移。

λ/nm

(2) FL

图2为4在不同溶剂中的FL谱图。由图2可见，4在二氧六环和水中的发射波长分别为390 nm和421 nm。这是因为芳基的引入扩大了碱基共轭体系，4受到激发后产生了π→π*跃迁，因激发态的极性比基态大，极性的增大会对激发态产生更大的稳定作用，所以发射峰有明显的红移趋势。

λ/nm

表1为4在不同溶剂中的光谱数据。由表1可见，4的斯托克斯位移值(Stocks shift)较大，且随溶剂极性增大而增大。在光谱学中，可以通过研究Stocks shift与极性参数ET(30)之间的关系，来判断化合物是否具备对极性敏感的光物理性质。

表1 4的光谱数据

表2 4与Pd2+的相互作用*Table 2 Interaction of 4 with Pd2+

*γ=n(4) ∶n(Pd2+)。

图3为Stocks shift与ET(30)的关系。由图3可知，4的Stocks shift与ET(30)之间具有较好的线性关系，其光物理性质随着极性的变化而产生规律性的改变。据此判断，4对极性敏感，可应用于极性的相关研究。

ET(30)/kcal·mol-1

由表1和图3还可见，4的荧光量子产率随溶剂极性增大而提高，在水溶液中最高(0.81)。与C5-位修饰尿苷衍生物相比[13-14]，量子产率显著提高。考察4对金属离子的识别性能时，选择水作为溶剂。

2.2 对金属离子的选择性识别

图4为4对金属离子(Mn+)的选择性识别作用。由图4可见，4的水溶液中分别加入K+、Ca2+、 Na+、 Mg2+、 Al3+、 Zn2+、 Fe3+、 Cu2+、 Mn2+、 Sn2+、 Cd2+、 Ni2+、 Co2+和Ag+，其发射峰位置与发射强度都没有明显变化。加入Pd2+后，溶液的荧光强度明显减弱。

荧光核苷类似物的荧光性质主要取决于其碱基结构[14-15]。为考察Pd2+的络合方式，我们也研究了化合物2在加入不同金属离子前后的荧光光谱变化，结果见图5。由图5可以看出，化合物2与4的荧光光谱相似，但对金属离子的响应不同。16种金属离子对化合物2均有明显的猝灭作用。2中的嘧啶环包含三个氮原子，其中3-位氮原子的两侧各有一个吸电子基团(羰基)，因此与金属的配位能力最弱。1-位和6-位的氮原子较容易与多种金属形成螯合配位，从而引起荧光猝灭现象。接入戊糖结构后，化合物2中的嘧啶1-位氮原子受到保护，在诸多金属离子中，Pd2+与化合物4的糖环醚键氧原子和嘧啶6-位氮原子最容易发生较强的配位作用，阻碍或减弱了4的分子内电荷转移(ICT)，从而导致其发光猝灭，荧光强度大幅下降。

λ/nm

λ/nm图5 2对Mn+的选择性*Figure 5 Selectivity recognition of 2 for Mn+*c(2)=5×10-6mol·L-1, [Mn+]=1×10-5mol·L-1。

Mn+K+Ca2+Na+Mg2+Al3+Zn2+Fe3+Cu2+Mn2+Cd2+Ab/a.u.558553566585575584561580557565Bc/a.u147145140138140138110140118114

ac(4)=5×10-6mol·L-1, [Pd2+]=5×10-6mol·L-1, [Mn+]=5×10-5mol·L-1;bPd2+加入前荧光强度;cPd2+加入后荧光强度。

λ/nm

[Pd2+]/×10-6 mol·L-1

Chart 1

表2为4与Pd2+的相互作用结果。由表2可知，4与Pd2+的摩尔比为1 ∶1时，荧光强度变化最大，因此可以得出4与Pd2+的配位比为1 ∶1。

根据图4，图5和表2的结果，结合类似杂环结构与金属配位的报道[16-17]，我们推测4中的糖环醚键氧原子和嘧啶6-位氮原子容易与Pd2+发生1 ∶1的较强配位，形成具有稳定五元环结构的络合物(Chart 1)。

图6和图7为不同浓度Pd2+对4荧光强度的影响。由图6和图7可知，随着Pd2+浓度的增大，荧光强度逐渐减弱。Pd2+浓度为5.0×10-7～5.0×10-6mol·L-1时，荧光强度与Pd2+浓度之间存在良好的线性关系，其拟合方程为Y=568.400 7-8.574 895×10-5[Pd2+] mol·L-1，相关系数R=0.995 06。以空白3倍标准偏差计算，检出限为2.0×10-7mol·L-1。根据该线性方程可知，可检测5.0×10-7～5.0×10-6mol·L-1Pd2+的含量。

综上可见，4在水溶液中对Pd2+有良好的识别性能。为进一步评价其对Pd2+的选择性识别性能，以K+、 Ca2+、 Na+、 Mg2+、 Al3+、 Zn2+、 Fe3+、 Cu2+、 Mn2+和Cd2+为干扰离子，考察了干扰离子存在下4对Pd2+的识别作用，结果见表3。由表3可见，干扰离子加入后，荧光强度变化很小，加入Pd2+后荧光强度明显减弱，因此可以认为干扰离子对4的选择性识别性能无影响。

合成了一种新型荧光核苷探针——5-(4-氟苯基)-6-氮杂尿苷(4)，并研究了4的性能。结果表明：4在水中的量子产率为0.81，对极性变化敏感；4可选择性识别Pd2+，在5.0×10-7～5.0×10-6mol·L-1能定量检测Pd2+。该研究不仅对环境和细胞中Pd2+的检测具有一定的应用价值，还扩大了核苷类荧光探针的应用范围。

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SynthesisandPropertiesofANovelAryl-modifiedUridineFluorescentProbe

ZHAI Wen-ji, ZHANG Xiao-xiao, HONG Jian-quan, ZHENG Chang-ge*

(School of Chemical and Material Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

O621.3; O614.82

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.10.17059

2017-03-19;

2017-08-20

国家自然科学基金资助项目(21562041); 中央高校基本科研业务费(JUSRP115A08)

翟文姬(1991-)，女，汉族，江苏连云港人，硕士研究生，主要从事荧光核苷类似物的合成及应用研究。 E-mail: 1585814711zwj@sina.com

郑昌戈，博士，副教授, E-mail: cgzheng@jiangnan.edu.cn