鼻息肉的全基因表达谱

白伟良，宋岩，王枭维，李婷，项清华，周倩，李进兴

（中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉科，沈阳 110004）

鼻息肉的全基因表达谱

白伟良，宋岩，王枭维，李婷，项清华，周倩，李进兴

（中国医科大学附属盛京医院耳鼻咽喉科，沈阳 110004）

目的研究鼻息肉的全基因表达谱情况，探寻其与正常鼻腔黏膜的基因表达差异。方法提取鼻息肉中的RNA，将RNA合成双链的cDNA，将标记的cDNA在Roche NimbleGen基因芯片上进行杂交。应用Axon GenePix 4000B scanner进行扫描，应用NimbleScan软件进行图像分析，探针及基因水平标准化后进行计算。结果与正常鼻腔黏膜相比，鼻息肉中有1 000个基因表达上调，占2.22% （1 000/45 033），有1 123个基因表达下调，占2.49%（1 123/45 033）。经过信号通路分析，发现在核糖体、蛋白酶体、柠檬酸循环、膀胱癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、子宫内膜癌、内质网蛋白合成、慢性髓样白血病、谷胱甘肽代谢等信号通路中相关基因表达上调，在嗅觉传导、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、细胞色素P450的化合物代谢、细胞色素P450的药物代谢、抗原加工和呈递、疟疾、移植物抗宿主疾病、视黄醇代谢、亚油酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸转换等信号通路中相关基因表达下调。结论鼻息肉的发生、发展与多个基因及信号通路的表达升高或降低有关，鼻息肉全基因表达谱的研究为探求鼻息肉的发生机制

提供了有益的线索。

鼻息肉； 基因芯片； 基因表达； 信号通路

Abstract ObjectiveTo analyze the gene expression profiles of nasal polyp and gene expression differences between the nasal polyp and normal nasal mucosa.MethodsTotal RNA from nasal polyp tissues was purified and synthesized into double-stranded cDNA.The cDNA was labeled and hybridized in a NimbleGen hybridization chamber. The slides were scanned using the Axon GenePix 4000B microarray scanner. Scanned images were analyzed using NimbleScan software. The probes and gene levels were standardized and calculated.ResultsCompared with normal nasal mucosa tissues，expression of 2.22% （1 000/45 033） of genes was up-regulated in all cases of nasal polyp tissues，while 2.49% （1 123/45 033） of genes were down-regulated in all cases of nasal polyp tissues. We found genes related to the ribosome，proteasome，citrate cycle （TCA cycle），bladder cancer，non-small cell lung cancer，glioma，endometrial cancer，protein processing in the endoplasmic reticulum，chronic myeloid leukemia，and glutathione metabolism were up-regulated.Genes related to olfactory transduction，natural killer cell-mediated cytotoxicity，metabolism of xenobiotics by cytochrome P450，drug metabolism-cytochrome P450，antigen processing and presentation，malaria，graft-versus-host disease，retinol metabolism，linoleic acid metabolism，and pentose and glucuronate interconversions were down-regulated.ConclusionMultiple genes or pathways may be involved in the occurrence and development of nasal polyp. Gene expression profiling provides insight into the mechanism of nasal polyp development.

Keywordsnasal polyp； gene chip； gene expression； signaling pathway

鼻息肉本质上是一种炎症疾病，是一个多步骤、多因素、序贯的复杂过程，目前已发现涉及到多种基因及产物的改变，多种信号通路相互调节和拮抗［1］。基因表达谱芯片是目前应用最为广泛的基因芯片，具有快速、高效、大规模、高通量及平行性获取相关生物信息的特点，可以同时分析多个基因的表达情况［2］。目前有关鼻息肉基因表达谱的研究较少，本研究应用基因芯片技术研究了鼻息肉全基因表达谱的情况。

1 材料与方法

1.1 临床资料

取临床经病理证实的鼻息肉3例，正常鼻腔下鼻甲黏膜组织2例，迅速放入液氮中冻存备用，所有患者术前均未接受激素等特殊治疗。

1.2 总RNA提取

按TRIzol试剂说明书提取每例组织标本的总的RNA，紫外分光光度仪测量提取的RNA的纯度，要求A260/A280为1.9～2.1。

1.3 基因表达谱芯片

应用Roche NimbleGen公司的12×135K基因芯片，可同时检测人类45 033个基因的表达。

1.4 RNA标记和杂交

应用美国Invitrogen公司的SuperScript ds-cDNA试剂盒，将5 μg 的RNA合成双链的cDNA。双链cDNA应用美国NimbleGen公司的基因表达分析方法进行标记和清洗，双链cDNA与4 μg RNase A在37 ℃孵育 10 min，用苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）清洗，然后用低温乙醇沉淀。NimbleGen单色DNA标记试剂盒标记cDNA。1 μg的双链cDNA与1单位的Cy3-9引物在98℃孵育10 min，然后加入100 pmol的脱氧核苷三磷酸和100单位的克列诺片段（美国New England Biolabs），37 ℃孵育2 h。加入0.1 μL的0.5 mol/L EDTA停止反应，异丙醇/乙醇将标记的双链cDNA提纯，将4 μg Cy3标记的双链cDNA在基因芯片上进行杂交，42 ℃孵育16～20 h。然后应用NimbleGen Wash缓冲液冲洗。

1.5 图像与数据的分析

基因芯片应用Axon GenePix 4000B scanner（美国Molecular Devices公司）进行扫描，数据应用NimbleScan软件进行分析，探针及基因水平标准化后进行计算，数据应用Agilent GeneSpring GX软件进行分析，筛选出比值＞2或＜0.5的基因。

2 结果

研究鼻息肉的基因表达谱，发现与正常鼻腔黏膜相比，3例鼻息肉中同时表达上调的基因有1 000个，占2.22% （1 000/45 033），同时表达下调的基因有1 123个，占2.49% （1 123/45 033）。见图1。

图1 鼻息肉的基因芯片Fig.1 Gene chip of nasal polyp

经过信号通路分析，发现在核糖体、蛋白酶体、柠檬酸循环、膀胱癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、子宫内膜癌、内质网蛋白合成、慢性髓样白血病、谷胱甘肽代谢等信号通路中有基因表达上调（图2），在嗅觉传导、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、细胞色素P450的化合物代谢、细胞色素P450的药物代谢、抗原加工和呈递、疟疾、移植物抗宿主疾病、视黄醇代谢、亚油酸代谢、戊糖和葡萄糖醛酸转换等信号通路中有基因表达下调（图3）。

图2 鼻息肉基因比正常鼻腔黏膜表达高的相关信号通路Fig.2 Higher gene expression in the pathway of nasal polyp compared to normal nasal mucosa

图3 鼻息肉基因比正常鼻腔黏膜表达低的相关信号通路Fig.3 Lower gene expression in the pathway of nasal polyp compared to normal nasal mucosa

3 讨论

鼻息肉是鼻腔黏膜的慢性炎症疾病，组织病理学研究发现，鼻息肉为呼吸上皮覆盖的高度水肿的疏松纤维组织，间质中有大量炎症细胞浸润，多以嗜酸性粒细胞浸润为主。鼻息肉的发病机制和病因仍不十分清楚［3］，已发现有多个基因、多个信号通路与鼻息肉发生有关，BENITO等［4］研究了LTC4S、CYSLTR1、PTGDR和NOS2A基因在鼻息肉中多形态分析，发现这些基因与鼻息肉临床关系密切，在鼻息肉发展中起重要作用。FIGUEIREDO等［5］发现细胞因子、趋化因子、生长因子基因、金属基质蛋白酶参与了鼻息肉的炎症及局部组织的重塑。有研究［6］报道，鼻息肉发生与干扰素α、转录因子、核因子κB、AP-1、p38MAPK、ERK 1/2、JNK、AKT等多个信号通路有关。基因芯片技术使得同时检测多个基因的表达成为可能，能够筛选和发现疾病新的基因或信号通路，FR CZEK等［7］应用基因芯片技术发现NOS2A、SERPINA1、UCP2、OXTR和IL-8在鼻息肉中表达升高，而LTF、KRT6B、LYZ、SD11B2和MMP-3表达降低。基因芯片有多种，本研究采用的是Roche NimbleGen的人全基因组表达芯片，可同时检测45 033个基因的表达。本研究发现，与正常鼻腔黏膜组织相比，鼻息肉组织中表达上调的基因有1 000个，占2.22%；表达下调的基因有1 123个，占2.49%，可见鼻息肉的发生、发展与多个基因的表达失调有关。

本研究进一步对表达失调的基因进行信号通路分析，发现鼻息肉组织中在核糖体、蛋白酶体、柠檬酸循环、膀胱癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、子宫内膜癌、内质网蛋白合成、慢性髓样白血病、谷胱甘肽代谢等信号通路中有基因表达上调。其中核糖体、蛋白酶体、柠檬酸循环等信号通路中的基因与鼻息肉的关系未见文献报道，而在膀胱癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、子宫内膜癌信号通路中有共同的CCND1和EGFR基因，在鼻息肉中表达均升高。LIN等［8］发现CCND1在鼻息肉组织中表达升高，DUAN等［9］认为EGFR等基因在鼻息肉中表达升高，在鼻息肉发生、发展、组织重塑过程中起重要作用。这些研究结果与本研究基因芯片结果相符合。而在内质网蛋白合成及谷胱甘肽代谢信号通路出现的基因，国内外未见与鼻息肉相关报道，但是其中GPX-1与上呼吸道感染及哮喘有一定关系，WON等［10］认为缺乏GPX-1表达的小鼠中卵清蛋白不能诱发哮喘，鼻息肉与哮喘关系密切，可见GPX-1有可能是研究鼻息肉新的候选基因。

本研究发现，在嗅觉传导、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、细胞色素P450的化合物代谢等多个信号通路中，有基因表达下调。其中尤其值得关注的是嗅觉传导通路，嗅觉传导通路中的嗅觉受体在嗅神经轴中起重要作用［11］。鼻息肉不仅阻塞溴素到达嗅区，影响嗅觉，本研究显示鼻息肉组织嗅觉受体基因表达也下降。当鼻息肉出现在嗅区时，会对嗅觉黏膜有一定影响，这也可能是鼻息肉引起嗅觉障碍的另一个机制，目前这方面研究未见报道。本研究发现，自然杀伤细胞介导的细胞毒性信号通路中的基因在鼻息肉中表达下降，其中ITGB2基因突变会导致呼吸道反复感染以及伤口不愈合［12］，鼻息肉中ITGB2基因表达下降无疑会促进鼻息肉的发生和发展，以往并无这方面的研究。其他细胞色素P450的化合物代谢、疟疾、抗原加工和呈递等信号通路中的基因与鼻息肉关系研究较少。通过基因芯片技术，可以对鼻息肉的基因表达谱有一个全新的认识，本研究筛选到了一些有价值的基因，通过信号通路分析，进一步明确了研究的方向，为鼻息肉基础研究提供了思路。

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（编辑 陈 姜）

Gene Expression Profiling in Nasal Polyp

BAI Weiliang，SONG Yan，WANG Xiaowei，LI Ting，XIANG Qinghua，ZHOU Qian，LI Jinxing

（Department of Otorhinolaryngology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

R765.2

A

0258-4646（2017）10-0895-04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20170927.1452.016.html

10.12007/j.issn.0258‐4646.2017.10.008

辽宁省科学事业公益研究基金（2013001010）；沈阳市科学技术计划（F11-264-1-07，F13-220-9-21）

白伟良（1972 -），男，教授，博士.

白伟良，E-mail：bweiliangcmu@163.com

2017-04-21

网络出版时间：2017-09-27 14:52