高效液相色谱法测定猪肾脏中赭曲霉毒素A

李玉平，侯亚莉，程千川，苏亮

（重庆市动物疫病预防控制中心，重庆401120）

高效液相色谱法测定猪肾脏中赭曲霉毒素A

李玉平，侯亚莉，程千川，苏亮

（重庆市动物疫病预防控制中心，重庆401120）

建立高效液相色谱法测定猪肾脏中赭曲霉毒素A（OTA）的含量。采用免疫亲和柱净化，Zorbax SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，乙腈-2%乙酸为流动相，激发波长（λem）为 332 nm，发射波长（λex）为 460 nm。结果显示，赭曲霉毒素A在0.1 ng/mL～10 ng/mL范围内线性关系良好（R2=0.999 9），平均加样回收率为77.3%～84.4%，平均相对标准偏差（RSD）为0.8%～1.3%。该方法简便、准确性好、灵敏度高，可用于猪肾脏中赭曲霉毒素含量的测定。

赭曲霉毒素A；免疫亲和柱；高效液相色谱法

Abstract：The orhratoxin A（OTA）content in the kidney of pigs was determined by high performance liquid chromatography.The Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）column was used with the mobile phase of acetonitrile-2%acetic acid and the detection of extraction wavelength 332 nm and emission wavelength 460 nm，and purified by immunoaffinity column.The results showed that the OTA content had good linear relationship in the range of 0.1 ng/mL-10 ng/mL（R2=0.999 9），the average recovery was 77.3%-84.4%，and relative standard deviation （RSD）was 0.8%-1.3%.The method was simple，accurate and sensitive for the determination of ochratoxin in the kidney of pigs.

Key words：ochratoxin A；immunoaffinity column；high performance liquid chromatography

赭曲霉毒素A（ochratoxins A，OTA）是由曲霉菌属和青霉菌属的某些细菌产生的一种有毒真菌次生代谢产物[1]，对动物和人类具有肾脏毒性、肝毒性、致突变、致畸性、致癌性和免疫抑制作用[2]。OTA广泛分布于各种饲料及饲料原料中，动物食用了含OTA的饲料后会导致体内蓄积，尤其是动物的肝脏、肾脏、肌肉及血液，残留在动物产品中的OTA可通过食品链传递给消费者，进而严重威胁着人类的健康。

目前，检测OTA常用方法有薄层色谱法（TLC）、酶联吸附免疫法（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）[3-8]。TLC法为半定量方法，灵敏度较低、方法繁琐、重复性差，且在提取过程中所需有机溶剂种类多、用量大，易污染环境，对人体也有较大危害。ELISA法测定结果受试剂盒种类、仪器灵敏度和实验温度等条件影响较大，假阳性率高。LC-MS/MS法省时、高效、灵敏，但成本高。HPLC法可进行定性和定量分析，灵敏度较高、回收率高、重复性好、定量结果准确，成为最常用的检测方法。近年来，我国对谷类、粮食等植物产品方面采用HPLC法测定OTA含量的研究较多，也制定了相关的检测标准和限量标准[9-10]，而对动物性产品中OTA检测方面的研究报道较少，因此建立快速、灵敏、简便的HPLC法，完善我国畜产品的OTA检测标准和限量标准是有必要的。参考国外相关文献[11-14]，本试验建立了采用免疫亲和柱净化，高效液相色谱-荧光检测法检测猪肾脏中的OTA含量的方法。该方法操作简便、检测结果准确、可靠，可为我国动物产品制定检测标准和限量标准提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

免疫亲和柱：北京华安麦科生物技术有限公司；OTA标准品：美国Sigma公司；甲醇、乙酸、乙腈、乙酸乙酯：色谱纯，美国Fisher公司；氯化钠、碳酸氢钠、吐温-20：分析纯，重庆迈克公司；水由Milli-Q纯水仪制造。

1.2 仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪-2475荧光检测器：美国Waters公司；ML204电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；TTL-Dcll型氮吹仪：北京同泰联科技发展公司；SIGMA 3K30高速离心机：德国SIGMA公司；SIR 4涡旋振荡器：德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

OTA标准储备溶液的配制：称取适量的OTA标准品，用苯-乙酸（99∶1，体积比）配制成 0.10 μg/mL 的标准储备溶液，于4℃冰箱内保存备用。

淋洗缓冲液：称取12.5 g氯化钠、5 g碳酸氢钠溶于水中，加入0.1 mL吐温-20，用水稀释至1.0 L。

洗脱液：甲醇∶乙酸=49∶1（体积比）配制。

1.3.2 液相色谱分析条件

色谱柱：ZorbaxSB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱温：30℃；流动相：乙腈-2%乙酸（45∶55，体积比）；流速：1.0 mL/min；荧光检测器：激发波长（λex）332 nm，发射波长为（λem）460 nm；进样量：50 μL。

1.3.3 样品的提取

将样品匀浆混匀，准确称取2.0 g（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加入0.6 mL浓度为1.0 mol/L的磷酸溶液（调节pH值约至2.5），再加入5.0 mL乙酸乙酯，混匀。以4 000 r/min离心5 min，移出上清液，重复提取3次，合并3次上清液。上清液中加入5.0 mL浓度为0.5 mol/L的碳酸氢钠（NaHCO3）试液，振荡提取3 min，4 000 r/min离心5 min，弃去上层提取液。剩余的提取液中加正己烷适量，静置，弃去正己烷层，用磷酸溶液调节pH值约至8.4，备用。

1.3.4 样品的净化

将免疫亲和柱置室温下预先平衡，加入提取液，调节流速不超过1.0 mL/min，使其缓慢通过免疫亲和柱。待柱内液体流干后，加入10.0 mL淋洗缓冲液进行淋洗，弃去全部流出液。把柱内残余液体抽干，加入3.0 mL洗脱液，收集洗脱液于玻璃刻度试管中，氮气50℃下吹干。精密加入1.0 mL流动相溶解，过滤膜后，采用高效液相色谱法测定。

2 结果与分析

2.1 标准品及样品溶液色谱图

根据1.3.2下色谱条件、1.3.3和1.3.4项下方法操作，得出OTA标准品溶液和样品溶液的色谱图，结果见图1。

图1 标准品（A）和样品（B）溶液色谱图Fig.1 HPLC of standard（A）and sample（B）

由图1可知，所得OTA色谱峰形对称，基线平稳，且样品中的OTA和杂质的分离度好。

2.2 标准曲线及回归方程

将0.1 μg/mL的OTA标准储备溶液，用流动相分别稀释制成浓度为 0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、10.0 ng/L 的标准溶液。根据相应的峰面积和对应的检测浓度制作标准曲线（见图2），此标准曲线的相关系数为R2=0.999 9，回归方程是y=144 488x-154.59。

图2 赭曲霉毒素A标准曲线Fig.2 Standard curve of ochratoxin A

2.3 检测限

将标准品溶液适当稀释后制得一系列不同浓度的标准品溶液，进样分析，以信噪比S/N=3时的质量浓度作为检出限，测得OTA的检出限为0.1 ng/mL。

2.4 精密度试验

取1.0 ng/mL的标准品溶液，连续进样6次，每次进样50 μL，根据峰面积计算其相对标准偏差（RSD），结果见表1。

表1 精密度试验结果Table 1 Results of precision assay

由表1可知，样品检测结果的RSD=0.7%，表明该方法的精密度良好。

2.5 回收率试验

称取样品约2.0 g，分别加入浓度为0.5、1.0、5.0 ng/mL赭曲霉毒素A标准品溶液各1.0 mL，按照1.3.3、1.3.4项下方法操作，1.3.2下色谱条件进行测定，每个浓度平行测定3次，测定其加标回收率及RSD（%），结果见表2。

表2 样品回收率试验结果Table 2 Results of recovery assay

由表2可知，3个不同浓度的平均回收率为77.3%～84.4%，其标准偏差（RSD）为0.8%～1.3%，表明本方法的准确度高，可满足检测的要求。

2.6 样品含量测定

称取10份样品，每份2.0 g（精确至0.01 g），按1.3.3和1.3.4项下的方法处理后，再用1.3.2下色谱条件进行测定。结果发现有4份样品中含有OTA，其余未检出，测得其含量分别为 0.151、0.225、0.185、0.201 ng/mL。

3 结论与讨论

3.1 提取溶剂的选择

赭曲霉素A（OTA）溶于极性溶剂和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水，试验中选择甲醇、乙腈、乙酸乙酯等作为提取溶剂，结果发现用乙酸乙酯提取回收率较高，结合试剂费用和安全性考虑，选择乙酸乙酯作为提取溶剂。此外，依据OTA溶于稀碳酸氢钠溶液的物理性质，试验中又采用了0.5 mol/L的碳酸氢钠试液对乙酸乙酯提取液进行了提取，进而更好的保证了OTA的提取。

3.2 净化条件的选择

肉制品及内脏组织中赭曲霉毒素的测定比谷物类食品中要困难很多，因为要去除大量小分子的蛋白质、干扰肽、磷脂和其他干扰物质，本文采用选择性高的免疫亲和柱来除去多数杂质成分，且使用时不需要活化。但免疫亲和柱具有选择性吸附的特性，样品在净化过程中，某些具有生物活性的杂质也会有少量吸附于柱子上，因此试验过程中预先采用正己烷对提取的样品进行了脱脂处理，从而提高了亲和柱对OTA的吸附。

3.3 流动相条件的选择

流动相对样品中待测组分的峰形、分离度及灵敏度均有影响，试验中分别考察了乙腈-水、乙腈-2%乙酸和甲醇-2%乙酸3种流动相的效果，结果表明选用乙腈-2%乙酸峰形较好。同时比较了不同比例的乙腈-2%乙酸（45∶55，体积比）、乙腈-2%乙酸（55∶45，体积比）的效果。因考虑到出峰时间、峰形及组分分离效果，故最后确定乙腈-2%乙酸（45∶55，体积比）作为流动相。

本文建立了一种使用高效液相色谱法测定动物肾脏中OTA的检测方法，结果表明，本方法简便易行，灵敏度和准确度高，线性关系良好，可以满足对样品中此种毒素的检测要求。

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Determination of Ochratoxin A in Kidney of Pigs by High Performance Liquid Chromatography

LI Yu-ping，HOU Ya-li，CHENG Qian-chuan，SU Liang
（Animal Disease Control and Prevention Center of Chongqing，Chongqing 401120，China）

2017-02-17

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.033

李玉平（1986—），女（汉），兽医师，硕士，从事兽药质量及兽药残留检测及研究工作。