烹饪食物中丙烯酰胺的检测及变化规律

李河山

（桂林理工大学，广西桂林541000）

烹饪食物中丙烯酰胺的检测及变化规律

李河山

（桂林理工大学，广西桂林541000）

建立一种快速、高效的固相萃取-高效液相色谱法检测烹饪食物中丙烯酰胺含量的分析方法，研究食物在烹饪过程中丙烯酰胺含量变化的规律。样品经5 mol/L NaCl溶液提取后，采用HLB固相萃取小柱进行净化和富集。以体积比20%的乙腈溶液作为流动相，200 nm的检测波长下检测，外标法峰面积定量。结果表明，丙烯酰胺标准溶液在0.05 μg/mL～5.00 μg/mL 浓度范围内线性良好，相关系数 R2为 0.999，检出限为 4.5 μg/kg，定量限为 15.0 μg/kg，加标回收率达到96.2%～98.5%，相对标准偏差（RSD）为1.8%～3.2%。

高效液相色谱；烹饪；丙烯酰胺

Abstract：A rapid and effective method was established for the determination of acrylamide in cooking food by high performance liquid chromatography （HPLC），and the changes of acrylamide content during the cooking process.After extracted by 5 mol/L NaCl solution，the sample was concentrated and purified by HLB solid phase extraction column.The separation of targeted use acetonitrile solution with volume ratio of 20%as mobile phase，with 200 nm as the detection wavelength and the peak area was quantified by external standard method.The linear range of acrylamide was in the range of 0.05 μg/mL-5.00 μg/mL with a correlation coefficient of 0.999.The detection limit was 4.5 μg/kg and the quantitative limit was 15.0 μg/kg.The recovery rate was 96.2%-98.5%，and the relative standard deviation（RSD）ranged from 1.8%to 3.2%.

Key words：high performance liquid chromatography（HPLC）；cooking；acrylamide

丙烯酰胺的分子量为70.08，是一种小分子化合物，结构式如图1所示。

图1 丙烯酰胺的结构式Fig.1 Structure of acrylamide

丙烯酰胺已被WHO国际癌症研究中心列为可能致癌物质，体外细胞实验和动物实验都证明丙烯酰胺可导致遗传物质的改变和癌症的发生[1]。食品中丙烯酰胺的形成是一系列复杂的多级反应过程，该过程包含离子型反应和自由基反应。例如，丙烯醛、丙烯酸与氨发生的化学反应，氨基酸分子的重新排列和转化、氨基酸和糖类物质发生美拉德反应等[2]。当食物在烹饪过程中被加热到120℃以上时，食物中的天门冬酰胺和还原性糖在高温加热过程中通过美拉德反应即可生成丙烯酰胺，此外食物的烹饪方式对丙烯酰胺的产生影响很大，也决定过程中丙烯酰胺的含量多少[3-5]。本试验在研究检测烹饪食物中丙烯酰胺含量方法的基础上，研究不同烹饪阶段以及不同烹饪方式对食物中丙烯酰胺含量的影响。

目前食品中丙烯酰胺检测方法主要有气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法等[6-12]。其中，气相色谱-质谱法在对样品的前处理过程中，要对目标物进行溴衍生化，方法比较繁琐，目标物回收率不高；液相色谱串联质谱法所需仪器非常昂贵，试验一般很难推广。本试验利用高效液相色谱法结合固相萃取技术对烹饪的食品进行丙烯酰胺的检测，针对烹饪食品中含有大量脂肪、蛋白质的特点，固相萃取技术可以很好地提高目标物的提取率以及净化目标物的溶液[13-19]。本试验选用HLB固相萃取柱用于丙烯酰胺样品净化，并对其条件进行摸索研究，建立一种快速、简便、净化效果好的固相萃取-高效液相色谱法分析烹饪食品过程中丙烯酰胺含量的方法，并用此方法研究烹饪不同阶段以及不同烹饪方式下食物中丙烯酰胺含量的变化。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

2695型高效液相色谱系统、2998型PDA检测器、HLB固相萃取小柱（规格3 cc，250 mg）：美国Waters公司；RV10型旋转蒸发仪：德国IKA公司；丙烯酰胺标准品：国家标准物质中心。

1.2 色谱条件

色谱柱：SepaxSapphireC18（4.6mm×250mm，5μm）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

1.3 方法

1.3.1 流动相体系的选择

分别研究6种不同体积分数的乙腈溶液（0%、20%、40%、60%、80%、100%）作为流动相，以此来考察对目标物的分离效果。

1.3.2 检测波长的选择

通过二极管阵列检测器对丙烯酰胺的标准溶液进行全波长扫描（扫描范围190 nm～350 nm），根据目标峰的响应值，选择有最大响应值的波长。

1.3.3 标准曲线的制作

准确称取10.0 mg丙烯酰胺标准品于10.0 mL容量瓶中，用甲醇完全溶解后定容至刻度，配制成1.0 mg/mL丙烯酰胺标准储备液。再吸取相应体积的标准储备液配制成 0.05、0.50、1.00、2.00、5.00 μg/mL 等系列浓度的标准溶液，进行仪器分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.3.4 样品前处理条件的优化

对前处理过程分别优化样品的提取溶剂以及提取方式的选择、样品的脱脂溶剂的选择；在选用HLB固相萃取小柱净化和富集目标物时，分别对洗脱液的选择、洗脱液体积等方面进行优化，以便选较合适的条件进行方法试验，结果以加标回收率作为比较依据。

1.3.5 加标回收试验及样品测定

在以上试验的优化条件下，利用已知含量的样品进行加标回收率试验，分别添加 50、100、200 μg/kg等3个梯度浓度的标准溶液，每个浓度平行测定3次，计算回收率。

1.3.6 烹饪过程中不同阶段以及不同烹饪工艺中食物的丙烯酰胺含量

以糖醋排骨为例，研究烹饪过程中丙烯酰胺的变化，样品中丙烯酰胺的测定按照优化后的试验方法进行。此外，还测定了不同烹饪工艺制成的食品中丙烯酰胺的含量。

2 结果与讨论

2.1 流动相体系的选择

由丙烯酰胺的结构可知，它是一种极性很强的化合物。因此在色谱柱中进行分离时，流动相的选择对其有很大影响。本试验比较了6种不同体积分数的乙腈溶液（0%、20%、40%、60%、80%、100%）作为流动相，以此来考察对目标物的分离效果。

浓度为2.0 μg/mL丙烯酰胺标准溶液的色谱图见图2所示。

图2 丙烯酰胺的色谱图Fig.2 The chromatograms of acrylamide

如图2所示，以纯水和纯乙腈为流动相分离目标物时，色谱图中没有出现相应的目标峰；以40%、60%、80%的乙腈溶液作流动相时，目标峰的色谱峰形较差，同时以80%的乙腈溶液做流动相时，色谱峰的基线稳定性不好。当以20%的乙腈溶液作为流动相时，目标峰的保留时间和峰形都较理想，基线平稳且无明显漂移的现象，色谱峰的分离效果也比较好，所以本试验选择20%的乙腈溶液作为分离丙烯酰胺目标峰的流动相组成。

2.2 检测波长的选择

丙烯酰胺的检测波长，各文献表述不太一致，其中最大波长可达260 nm，最小为197 nm[21-24]。为提高试验的准确性和灵敏度，本试验通过二极管阵列检测器对丙烯酰胺的标准溶液进行全波长扫描，选择目标物有最大响应值的波长。丙烯酰胺的全波长扫描图见图3。

图3 丙烯酰胺的全波长扫描图Fig.3 Full wavelength scanning chart of acrylamide

结果如图3显示，丙烯酰胺的最大吸收波长在190 nm～220 nm范围内，然后分别比较在190、200、210、220 nm波长下的丙烯酰胺标准溶液色谱图。结果显示，在190 nm和200 nm下丙烯酰胺色谱峰的吸收值最高，但是在190 nm下色谱峰的基线噪音比较大，所以本试验选择200 nm作为丙烯酰胺目标物的检测波长。

2.3 标准曲线的制作

为了验证丙烯酰胺在20%的乙腈溶液流动相中的线性关系，配制了浓度为0.05、0.50、1.00、2.00、5.00 μg/mL的系列标准溶液。试验结果表明，丙烯酰胺在 0.05 μg/mL～5.00 μg/mL 内均具有良好的线性关系（R2＞0.99）；依据色谱峰的信噪比的3倍确定检出限（LOD），信噪比的10倍确定定量限（LOQ），得到丙烯酰胺组分的 LOD 为 4.5 μg/kg，LOQ 为 15.0 μg/kg，结果见表1。

表1 丙烯酰胺的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限Table 1 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of acrylamide

2.4 样品提取方法的优化

2.4.1 提取溶剂的选择

丙烯酰胺极易溶于水、甲醇、乙醇等溶剂，特别是在水中的溶解度很大，所以一般用水作为目标物的提取溶剂。但是考虑到实际样品中含有蛋白质、油脂等物质，如果直接用水提取，容易发生乳化现象，所以一般会用NaCl溶液代替纯水作为提取溶剂。NaCl溶液在提取目标物的同时，会使样品中的蛋白质等物质发生盐析现象，从而利用丙烯酰胺的提取。本试验分别选用5 mol/L NaCl溶液与纯水作为提起溶剂，再分别选用超声提取和高速均质等提取方式进行比较。不同提取溶剂以及提取方式对回收率的影响见表2。

表2 不同提取溶剂以及提取方式对回收率的影响Table 2 Effects of different solvents and extraction methods on recovery

从表2结果可以看出，5 mol/L的氯化钠溶液作为提取溶剂，并结合高速均质的提取方式进行样品中丙烯酰胺提取的效果最好。

2.4.2 脱脂溶剂的选择

烹饪过程中食物中的油脂会影响丙烯酰胺目标物的提取及纯化效果，所以一般要对样品进行脱脂处理。由于丙烯酰胺不溶于烷烃化合物，故本研究分别选取正己烷、环己烷、石油醚3种溶剂对样品进行脱脂，并比较脱脂过程中三者对丙烯酰胺损失率的影响。不同脱脂剂对丙烯酰胺损失率的影响见表3。

表3 不同脱脂剂对丙烯酰胺损失率的影响Table 3 Effect of different degreasing agents on the loss rate of acrylamide

如表3结果所示，正己烷、环己烷和石油醚对样品进行脱脂后，丙烯酰胺的损失率分别为1.8%、3.0%和4.6%，这说明脱脂步骤并不会对丙烯酰胺的提取造成很大影响。其中正己烷作为脱脂溶剂时，丙烯酰胺的损失率最小为1.8%，故本试验选择正己烷作为样品的脱脂溶剂。

2.5 固相萃取条件的优化

2.5.1 洗脱液的选择

试验选用HLB固相萃取小柱对目标物进行提取和纯化，在对小柱的洗脱液方面分别比较了超纯水、25%、50%、75%、100%的甲醇溶液5种溶液的洗脱效果，并分别对 3个浓度 0.05、0.25、1.00 μg/mL 的丙烯酰胺标准品进行洗脱，比较目标物的回收率。不同体积分数甲醇溶液作为洗脱液对丙烯酰胺回收率的影响见图4。

图4 不同体积分数甲醇溶液作为洗脱液对丙烯酰胺回收率的影响Fig.4 The effect of different volume fractions of methanol solution on the recovery of acrylamide

结果如图4所示，当选用纯水进行洗脱时，3种浓度的目标物回收率都比较高；但是随着溶液中甲醇比例的增加，目标物的回收率有所下降。当甲醇体积分数增长到75%时，已检测不到0.05 μg/mL的目标物含量，所以本试验选择超纯水作为样品的洗脱溶剂。

2.5.2 洗脱液体积的选择

在上述选用超纯水作为HLB固相萃取小柱洗脱液的基础上，比较了洗脱液体积对目标物回收率的影响。分别比较了超纯水1、2、3、4、5 mL 5种体积对丙烯酰胺目标物洗脱效果的影响。洗脱液体积对丙烯酰胺回收率的影响见图5。

图5 洗脱液体积对丙烯酰胺回收率的影响Fig.5 The effect of eluent volume on the recovery of acrylamide

如图5所示，随着洗脱液体积不断增加，丙烯酰胺的回收率逐渐升高，但洗脱液体积达到3 mL以后再增加洗脱剂体积，丙烯酰胺回收率并没有明显增加，所以从节约的角度考虑，选择3 mL为洗脱体积较合适。

2.6 加标回收与相对偏差

在以上试验的优化条件下，利用已知含量的样品进行加标回收率试验，在分别添加50、100、200 μg/kg 3个梯度浓度的标准溶液，每个浓度平行测定3次，测定结果见表4。

表4 方法的回收率及相对标准偏差（n=3）Table 4 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=3）

由表4可见，丙烯酰胺的加标回收率为96.2%～98.5%，相对标准偏差（RSD）为1.8%～3.2%，表明本试验所建立的方法具有可靠的准确度和精密度。

2.7 烹饪过程中不同阶段以及不同烹饪工艺中食物的丙烯酰胺含量

本试验以糖醋排骨为例，研究烹饪过程中各个阶段丙烯酰胺的含量情况。测定方法按照本试验优化后的试验条件进行，整个烹饪工艺分为7个阶段来进行测定。在烹饪过程中丙烯酰胺含量的变化见图6。

图6 在烹饪过程中丙烯酰胺含量的变化（n=3）Fig.6 The change of acrylamide content during the cooking process（n=3）

如图6所示，在烹饪糖醋排骨的过程中，从油炸过程开始时整个食物的丙烯酰胺的含量开始快速上升，并一直保持到食物烹饪完为止，但是远低于规定的每日平均0.1 mg/kg体重才会有致癌风险的限量值[25]。

3 结论

建立一种固相萃取-高效液相色谱法检测烹饪食品中丙烯酰胺含量的分析方法。结果表明，在体积比20%的乙腈溶液作为流动相体系中，丙烯酰胺能得到良好的基线分离，其峰型良好，出峰时间合适。在200 nm的检测波长下，丙烯酰胺在 0.05 μg/mL～5.00 μg/mL内均具有良好的线性关系，并得到丙烯酰胺LOD为4.5 μg/kg，LOQ 为 15.0 μg/kg。样品以 5 mol/L NaCl溶液作为提取溶剂，并结合高速均质的提取方式进行样品中丙烯酰胺提取的效果最好；采用HLB固相萃取柱法，以3 mL超纯水作为洗脱溶剂，可实现对目标物的净化与富集。丙烯酰胺的加标回收率为96.2%～98.5%，相对标准偏差（RSD）为1.8%～3.2%，表明本试验所建立的方法具有可靠的准确度和精密度。并以此检测方法研究食品烹饪过程中丙烯酰胺的变化过程，发现食物以高温油炸烹饪工艺后丙烯酰胺的含量较高。

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Determination and Change Rule of Acrylamide in Cooking Food

LI He-shan
（Guilin University of Technology，Guilin 541000，Guangxi，China）

2017-04-11

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.029

李河山（1979—），男（壮），讲师，硕士研究生，研究方向：旅游烹饪与营养。