焦磷酸测序法和Sanger测序法检测丙型肝炎病毒基因分型的方法学比较

渠滕，田文君，刘义庆，刘春梅，张庆，崔朝杰，邱旸

（山东大学附属省立医院 临床检验医学部，山东 济南 250021）

焦磷酸测序法和Sanger测序法检测丙型肝炎病毒基因分型的方法学比较

渠滕，田文君，刘义庆，刘春梅，张庆，崔朝杰，邱旸

（山东大学附属省立医院 临床检验医学部，山东 济南 250021）

目的探讨焦磷酸测序法检测丙肝分型在临床应用中的准确性和敏感性，评价其方法的优缺点。方法收集100例丙肝患者的血浆标本，分装相同的2份，通过焦磷酸测序法和Sanger测序法分别进行丙型肝炎病毒基因分型的检测，对两种测序方法的结果进行比较。结果焦磷酸测序法和Sanger测序法检测HCVRNA基因分型时，100例标本中，92例结果一致，8例结果不一致，一致率为92%。其中，HCV-RNA病毒载量＞1×104IU/ml有80例，其测序结果完全一致为100%，HCV-RNA病毒载量＜1×104IU/ml有20例，其中焦磷酸测序共检测20例，Sanger测序法共检测14例，12例结果相同。结论焦磷酸测序法检测丙型肝炎病毒基因分型，不仅结果准确可靠，而且与Sanger测序法比较，其敏感性更高。此外，焦磷酸测序还可以进行定量分析。

丙型肝炎；焦磷酸测序；Sanger测序

Abstract:ObjectiveTo compare the accuracy and sensitivity of Pyrosequencing and Sanger sequencing in detection of hepatitis C virus genotypes.MethodsPyrosequencing and Sanger sequencing were used to detect the hepatitis C virus genotypes using plasma of the same 100 patients,results of the two methods were analyzed.ResultsThe results were consistent in 92 of 100 cases when detecting the HCV-RNA genotyping,of which the concordance rate was 92%.There were 80 samples whose HCV-RNA concentration was above 1×104IU/ml,with completely consistent sequencing results of the two methods.And there were 20 samples whose HCV-RNA concentration wasbelow 1×104IU/ml,allofwhich were detected successfully by Pyrosequencing,while 14 of which were detected successfully by Sanger sequencing,12 of which had identical results.ConclusionsCompared with Sanger sequencing,Pyrosequencing can make results accurate and reliable,and the sensitivity of which is higher.In addition,Pyrosequencing can be used for quantitative analysis.

Keywords:hepatitis C;Pyrosequencing;Sanger sequencing

丙型肝炎（丙肝）是一种由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）引起、以肝脏受累为主，肾脏、骨髓和甲状腺等其他器官均可受累的全身性疾病[1]。人体感染HCV后，因急性丙肝常呈亚临床感染，症状轻微，常常不能引起患者的重视而导致50%～80%的丙肝患者发展成为慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC），而CHC自发清除病毒的比例很低，如果不能进行及时有效的抗病毒治疗，绝大多数将逐渐发展为肝硬化、肝功能失代偿，甚至肝细胞癌，严重危害患者的健康和生命[2-3]。据世界卫生组织报告，全球丙型肝炎流行率平均为3%，每年新发HCV感染300～400万例，估计已有1.3～1.7亿慢性HCV感染者。每年约35万人死于与HCV感染相关的肝脏疾病。据估计，今后10～15年内，丙型肝炎相关死亡将继续上升，到2015年丙型肝炎相关死亡将增加2倍，2025年增至3倍[4-6]。在我国，根据2006年全国血清流行病学调查推算，我国一般人群HCV感染者约为560万[7]。目前，PR方案（聚乙二醇化干扰素α联合利巴韦林）仍是我国现阶段HCV感染者抗病毒治疗的主要方案，可应用于所有基因型HCV现症感染，同时无治疗禁忌证的患者。在PR治疗基因1型、2/3型患者中，不同基因型患者RBV的用量不同，据应答指导治疗（responsed guidedtherapy，RGT）的调整策略也不一样，同时丙型肝炎防治指南（2015更新版）推荐意见中第6条建议抗病毒治疗前应根据病毒载量、基因分型、肝纤维化分期以及有无抗病毒治疗禁忌证等综合评估[8]。

目前，HCV基因分型检测方法主要有直接测序、限制性片段长度多态性分析法（RFLP）、特异性引物聚合酶链反应（PCR）法、特异性探针荧光PCR法和基因芯片法等[9]。Sanger测序法采用的就是直接测序法，是一代测序法的经典代表，发展较为成熟，测序片断较长，成本相比较低，但是只能测序，无法准确定量，同时操作耗时、烦琐、通量受局限，在临床应用不方便。焦磷酸测序技术是介于一代测序和二代测序之间的一种测序手段，不仅检测项目灵活可以同一批次检测多个项目，而且焦磷酸测序检测成本较低、耗时短、通量高和灵敏度高，适合临床常规检测的推广，但其测序的片断一般较短＜80 bp（大多数需要检测的与疾病相关的已知基因片断都很短），更适合对特定已知序列的定量分析[10]。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月-2016年10月在本院检测HCV-RNA阳性的血浆标本100例，采用COBAS Taq Man 48全自动病毒载量仪仪器及相关试剂盒（购于瑞士罗氏公司）检测，检测下限为15 IU/ml，其中，HCV-RNA病毒载量＞104IU/ml有80例，HCV-RNA浓度＜104IU/ml有20例。

1.2 主要试剂和仪器

病毒核酸纯化柱试剂盒（德国Qiagen公司），焦磷酸测序试剂盒（德国Qiagen公司），低温高速台式离心机（德国Eppendorf公司），荧光定量PCR仪（美国ABI公司），焦磷酸测序仪（Pyro Mark Q24 MDx，德国Qiagen公司）。

1.3 方法

1.3.1 焦磷酸测序①设置Pyro Mark Q24运行文件：点击新建程序按钮，输入运行的参数，设置测序板面板，从“Tools”菜单中选择“Pre Run Information”，打印测序信息表，关闭运行菜单，拷贝到一个USB盘中。将PCR产物结合到链霉亲和素Beads上：按照2 μl磁珠加40 μl结合缓冲液再加28 μl高纯水配置用于DNA亲和反应的Master mix，加入70 μl的Master mix到8联管中，按照设定的Pyro Mark Q24程序加入10 μl PCR产物到每一个孔中，用PCR8联盖密封8联管，1 400 r/min摇动10 min；②测序引物退火缓冲液的配制：按照每孔2.5 μl测序引物加22.5 μl的退火缓冲液进行足量配制，按照设定的Pyro Mark Q24程序加25 μl稀释的测序引物到PyroMark Q24测序板的孔上；③单链DNA模板的制备：在真空工作站中，1号槽加入70%乙醇50ml，2号槽加入变性缓冲液40 ml，3号槽加入洗液50 ml，4号槽加入高纯水50 ml，5号槽加入高纯水70 ml。打开真空泵，将真空工具在5号位清洗15 s，移动到PCR8联管吸附磁珠15 s，依次在1、2和3号位清洗5、5及10 s；④引物杂交：将真空工具真空阀关闭，放入含有测序引物的Pyro Mark Q24测序板中，充分摇动释放磁珠，在80℃杂交2 min，室温冷却10 min；⑤运行Pyro Mark Q24进行测序：按照Pre Run运行报告将核酸，酶、底物分别按照合适的体积加入卡夹，打开测序板模块，放入卡夹和测序板，插入USB选择主菜单中的“Run”，按“OK”。

1.3.2 Sanger测序由上海申友生物技术有限责任公司使用ABI 3730xl测序仪测序。

1.4 统计学方法

数据分析采用13.0统计软件，计数资料以率（%）表示，比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2种测序法的敏感性

血 HCV-RNA 为 104、5000、2000 及 1000IU/ml，重复10次，血HCV-RNA≥2 000 IU/ml的标本，焦磷酸测序法和Sanger测序法能稳定地检测出丙型肝炎病毒的基因分型，阳性检出率均为100%，且两种方法的序列图谱清晰，满足临床对丙型肝炎病毒基因分型检测的需求；血HCV-RNA≤2 000 IU/ml的标本，焦磷酸测序法无法稳定检出，虽可分出丙型肝炎病毒基因分型，但信号强度低、分辨率差，Sanger测序法阳性检出率为0；另外，两种方法检测10份健康对照者血浆标本，两种方法均低于检出限。

2.2 2种测序法检测丙型肝炎病毒基因分型的结果比较

将100例丙肝患者血浆标本分装相同的两份，通过焦磷酸测序法和Sanger测序法分别进行丙型肝炎病毒基因分型的检测，100例丙肝患者血浆标本检测结果显示：焦磷酸测序法共测出100例，未测出0例，检出率为100%；Sanger测序法测出94例，6例未测出，检出率为94%。其中，92例结果一致，8例结果不一致，总体一致率为92%。焦磷酸测序法和Sanger测序法检测丙型肝炎病毒基因1b、2a以及其他型别的检出例数的比较，经χ2检验差异无统计学意义（P＞0.05）。标本测序结果资料。见表1。

表1 2种测序法检测丙型肝炎病毒基因分型结果比较例（%）

2.3 2种测序法对不同丙肝病毒载量组的检测结果比较

按病毒载量的不同将100例患者分为高载量组（HCV-RNA病毒载量＞104IU/ml）80例和低载量组（HCV-RNA病毒载量＜104IU/ml）20例。2种方法在两组的丙肝分型检测结果比较（见表2）。高通量组的HCV-RNA病毒载量＞104IU/ml，有80例，其测序结果完全一致为100%，低通量组的HCV-RNA病毒载量＜104IU/ml，有20例，其中焦磷酸测序供测出20例，Sanger测序法测出14例，12例结果相同，2例不同。检测高载量丙型肝炎病毒基因时，焦磷酸测序法和Sanger测序法的检出率无差异，而检测低载量丙型肝炎病毒基因时，焦磷酸测序法和Sanger测序法检出例数的比较，经χ2检验差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 2种方法对不同病毒载量组的检测结果比较

HCV-RNA高水平载量、低水平载量和正常人2种测序方法的测序图（见附图）。应用Sanger测序法对丙型肝炎病毒分型检测，对于高病毒载量样本测序结果直观，但存在结果分析较为复杂，不能对突变株进行定量检测的问题；对于低载量样本，结果判读存在很大偏差，重复实验结果重现性很差，不能很好的判断型别；阴性标本测序结果呈现混乱的峰形图，无实际意义。而对于丙型肝炎病毒高载量样本，焦磷酸法分型测序结果直观、峰值高、读取简单和定量精确等特点；对于低载量样本测序结果存在基线不稳、峰值偏低的情况，但重复实验结果具备很好的重现性，不影响结果的判读；阴性标本无PCR扩增曲线，对PCR产物测序亦无峰值出现。

分别比较各组中2种检测方法的整体一致性较好。但高载量组与低载量组之间两种方法检测结果比较，高载量组的检测结果，两种方法一致率更好，低载量组焦磷酸测序法具有更高的检测率和更低的漏检率，其敏感性可能略优于Sanger测序法。

2.4 2种测序法对不同低病毒载量组的检测结果比较

通过表2对比结果可知，两种测序方法在对丙型肝炎病毒基因分型的检测一致性较高，但在HCV-RNA病毒载量＜104IU/ml中，测序结果有所差异，现将20例HCV-RNA病毒载量＜104IU/ml的标本按病毒载量分成2组，分别用焦磷酸法和Sanger法进行测序，其检测结果比较。见表3。

标本病毒载量在104～5 000 IU/ml范围中，检测12个样本，焦磷酸测序法和Sanger测序法均可检出，且测序结果一致性为92%；当病毒载量＜5 000 IU/ml时，检测8个样本，焦磷酸法检出8个，检出率为100%，Sanger测序法检出2个，检出率为25%，其中，两种方法检测一致的标本数为1，一致率为12.5%。检测病毒载量为104～5 000 IU/ml组丙型肝炎病毒基因时，焦磷酸测序法和Sanger测序法的检出例数无差异，而检测病毒载量＜5 000 IU/ml组的丙型肝炎病毒基因时，焦磷酸测序法和Sanger测序法检出例数经χ2检验差异有统计学意义（P＜0.05）。

附图 2种测序法在不同丙肝病毒载量组的测序图

表3 2种测序法在不同低病毒载量组的检测结果比较 %

通过2种测序方法对比可以看出在高载量检测中，2种方法一致性更好，低载量检测中焦磷酸测序法可能有较高的检测率，其敏感性可能略优于Sanger测序法。故建议进行丙肝分型检测前应先进行HCV-RNA定量检测，分型标本病毒载量在＞104IU/ml效果最佳，若＜104IU/ml，可优先考虑焦磷酸测序法。

3 讨论

丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒感染引起、以血源性传播为主的传染性疾病，大部分患者感染HCV后会发展成为慢性丙型肝炎，可导致肝脏慢性炎症反应、坏死和纤维化，更有部分患者发展为肝硬化，甚至是肝癌，对人类的健康构成严重威胁。而且近年来我国丙肝报告病例数及报告发病率快速上升，2011年报告发病率就达到12.97/10万[11]，但通过科学的抗病毒治疗，可以达到清除病毒、改善肝组织学、降低肝硬化发生率、防止肝脏功能衰竭和肝癌发生的目标[12]。HCV分为6个基因型和多个亚型，不同基因型会导致不同的临床表现及后果，尤其是对干扰素治疗的反应性有很大差异，因此，在治疗前了解HCV的基因型，不仅有助于预测患者病情，更重要的是可根据病毒的基因型采用更合理有效的治疗方案，从而既能节约治疗费用又能获得好的效果[13-15]。

本实验发现，两种测序方法在对丙型肝炎病毒基因分型检测的一致性高，无差异。100例标本中，有92例结果一致，一致率为92%。其中，HCV-RNA病毒载量＞104IU/ml有80例，其测序结果完全一致为100%，HCV-RNA病毒载量＜104IU/ml有20例，其中焦磷酸测序共检测20例，Sanger测序法共检测14例，12例结果相同。初步证明，在检测丙型肝炎病毒基因分型方面，焦磷酸测序法快速准确，而且与目前应用较为成熟普遍的Sanger测序法比较，其敏感性更高。此外，焦磷酸测序还可进行甲基化分析（特定位点定量），且通量灵活（1～24）。因此，建议进行丙肝分型检测前应先进行HCV-RNA定量检测，分型标本病毒载量＞104IU/ml效果最佳，若＜104IU/ml，可考虑焦磷酸测序法。

[1]张长江,朱研,王小红.慢性丙型肝炎病毒感染的肝外表现[J].中华传染病杂志,2011,29(2):124-128.

[2]卢捷,谢青.直接抗病毒药物治疗丙型肝炎的研究新进展[J].临床内科杂志,2015,32(8):518-521.

[3]丁洋,窦晓光.丙型肝炎规范化与个体化治疗[J].临床内科杂志,2015,32(8):515-517.

[4]任红.丙型肝炎防治,任重道远[J].中华肝脏病杂志,2013,21(6):401-402.

[5]李杰,庄辉.病毒性肝炎流行病学进展[J].肝脏,2012,17(1):2-5.

[6]庄辉.病毒性肝炎流行病学研究进展[J].中国继续医学教育,2010,2(3):1-5.

[7]李杰,陈杰,庄辉.丙型肝炎的流行病学[J].实用肝脏病杂志,2012,15(5):379-381.

[8]中华医学会肝病学分会.中华医学会感染病学分会.丙型肝炎防治指南更新版[J].中华肝脏病杂志,2015,23(12):906-923.

[9]濮翔科,杭双熊,申红玉,等.常州地区丙型肝炎病毒基因分型及临床分析[J].放射免疫学杂志,2012,25(6):663-665.

[10]王谦,杜亚梅,张国军,等.焦磷酸测序法与Sanger测序法检测CYP2C19*17基因多态性方法学对比研究 [J].中国医药生物技术,2014,9(3):222-224.

[11]秦倩倩,郭巍,王丽艳,等.1997-2011年中国丙型肝炎流行特征分析[J].中华流行病学杂志,2013,34(6):548-551.

[12]王剑,杨瑞锋,魏来,等.丙型肝炎病毒基因型及其宿主基因型的检测及临床意义[J].中华检验医学杂志,2012,35(2):97-100.

[13]冯颖.干扰素联合利巴韦林治疗不同病毒基因型慢性丙型肝炎患者的疗效[J].中国医药,2013,8(8):1124-1125.

[14]温先勇,唐敏,邓正华,等.中国西南三地HCV基因型的分布及临床特征[J].中国现代医学杂志,2016,26(23):42-46.

[15]陈金栋,许新,孙东红,等.23例丙型肝炎患者全髋关节置换术回顾性分析[J].中国现代医学杂志,2016,26(16):105-108.

Comparsion of Pyrosequencing and Sanger sequencing in detection of hepatitis C virus genotypes

Teng Qu,Wen-jun Tian,Yi-qing Liu,Chun-mei Liu,Qing Zhang,Chao-jie Cui,Yang Qiu
(Department of Clinical Laboratory Medicine,Shandong Provincial Hospital of Shandong University,Jinan,Shandong 250021,China)

R135.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.012

1005-8982（2017）21-0066-05

2017-02-20

邱旸，E-mail：qpinger@163.com，Tel：15863199632