降钙素基因相关肽对脂多糖诱导血管平滑肌细胞TLR4/NK-κB及炎症因子表达的影响*

王芳，周祥群，付洁

（1.海南省第三人民医院 心血管内科，海南 三亚 572000；2.新乡医学院组织胚胎学教研室，河南 新乡 453003）

降钙素基因相关肽对脂多糖诱导血管平滑肌细胞TLR4/NK-κB及炎症因子表达的影响*

王芳1，周祥群1，付洁2

（1.海南省第三人民医院 心血管内科，海南 三亚 572000；2.新乡医学院组织胚胎学教研室，河南 新乡 453003）

目的探讨降钙素基因相关肽（CGRP）对脂多糖（LPS）诱导的血管平滑肌细胞（VSMCs）TLR4/NK-κB及炎症因子表达的影响。方法贴壁法培养VSMCs，根据不同的处理方案，分为对照组、LPS处理组、CGRP组、（LPS+CGRP）组及（LPS+CGRP+C8-37）组；ELISA 检测不同组 VSMCs中白介素 1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和CGRP基因表达水平，免疫印迹法（Western blot）检测不同组VSMCs中Toll样受体4（TLR4）、IκBa及p65蛋白表达水平。结果①LPS处理VSMCs后，随着LPS浓度的升高，IL-1β和TNF-α表达水平成梯度增加，并于1 000 ng/ml时分泌水平最高（P＜0.05），在8 h时达到峰值（P＜0.05）；②CGRP剂量依赖性降低LPS诱导IL-1β和TNF-α的表达（P＜0.05），并于100 nmol/L时达到低峰点（P＜0.05）；③CGRP能抑制LPS诱导的细胞TLR4蛋白的积累（P＜0.05），抑制IκBa与p65蛋白的磷酸化水平（P＜0.05）；④CGRP阻断剂C8-37可以逆转CGRP对LPS刺激的VSMCs中IL-1β和TNF-α表达（P＜0.05），拮抗CGRP对TLR4和NK-κB的抑制（P＜0.05）。结论CGRP通过抑制TLR4蛋白的积累，阻断NF-κB信号蛋白IκBa与p65的磷酸化，进而削弱LPS诱导的细胞炎症因子IL-1β和TNF-α的激活，抑制LPS诱导的VSMCs炎症的激活。

降钙素基因相关肽；血管平滑肌细胞；Toll样受体4；NF-κB

Abstract:ObjectiveTo investigate the effectofcalcitonin gene-related peptide (CGRP)on lipopolysaccharide(LPS)-induced expressions of Toll-like receptor 4(TRL4)/NK-κB and cytokines in vascular smooth muscle cells (VSMCs).MethodsVSMCs were cultured and divided randomly into five groups:blank control group,LPS-insulted group,CGRP-stimulated group,LPS+CGRP stimulated group and LPS+CGRP+C8-37 group.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)was used to measure concentrations of IL-1β and TNF-α.Western blot was used to detect the expression of TLR4,IκBa and p65.ResultsLPS upregulated the expressions of IL-1β and TNF-α in a both time-and dose-dependent manner (P＜0.05),which reached the peak value when the cells were insulted by LPS at 1,000 ng/ml for 8 hours.CGRP reduced the LPS-induced expressions of IL-1β and TNF-α in a dose-dependent manner,which reached the lowest values when CGRPwas under 100 nmol/L (P＜0.05).Moreover,LPS-treated cells exhibited significant decrease of TLR4 and phosphorylation of IκBa and p65,which was attenuated significantly by CGRP(P＜ 0.05).As a specific CGRP antagonist,C8-37 reversed the expression levels of IL-1β and TNF-α in VSMCs stimulated by LPS.ConclusionsThe present study demonstrates that CGRP can significantly block LPS-induced inflammatory response in VSMCs through inhibition of TLR4-mediated NF-κB signaling pathway.

Keywords: calcitonin gene-related peptide;vascular smooth muscle cell;Toll-like receptor 4;NK-κB

动脉粥样硬化是由多种因素共同作用的一种慢性炎症性血管疾病，在其发展过程中，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）发生特异性形态与功能改变，细胞收缩和合成表型发生转换，进而激活炎症过程，促使VSMCs分泌多种促炎症介质（如细胞因子、趋化因子及黏附分子），最终促进血管病理生理发展、疾病进展，导致不良临床事件发生[1]。当前研究显示，慢性炎症是动脉粥样硬化心血管疾病的主要致病机制[2]，因此，识别调节VSMCs的炎症反应机制对于治疗动脉粥样硬化性心血管疾病的具有重要意义。降钙素基因相关肽（calcitonin generelated peptide，CGRP）是由37个氨基酸组成的重要生物活性多肽，具有下降血压、降低外周阻力、舒张肾动脉及增加肾血流量等作用，参与机体多种生理和病理过程[3]。最近的研究证实，CGRP在免疫应答和抗炎症方面具有重要调节作用[4-5]，但对CGRP是否调节VSMCs炎症激活及相关机制尚未明确。本实验通过脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的 VSMCs炎症反应，探讨CGRP对LPS诱导的VSMCs TLR4/NK-κB表达及其炎症的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂

无特殊病原体（SPF）级雄性SD大鼠[许可证号：SCXK（京）2012-0001，北京维通利华实验动物技术有限公司]，9～11周龄，体重300～350 g。不含钙镁磷酸盐缓冲液（D-PBS）、DMEM细胞培养液及L-谷氨酰胺（购自美国Hyclone公司），α-Sarcomeric actin（α-SM-actin）、Anti-TLR4、Anti-IκBa、Anti-p-IκBa、Anti-p-p65、Anti-p65 及 Anti-α-Tubulin（购自美国Abcam公司），辣根过氧化物酶标记二抗（HRP）（购自美国 Cell Signaling Technology公司），DMEM、胎牛血清及Trypsin-EDTA胰酶消化液（购自美国Gibco公司）；BCA蛋白定量检测试剂盒（购自陕西省西安飞扬生物科技有限公司），RIPA裂解液（中）（购自上海碧云天生物技术有限公司），Calcitonin Gene Related Peptide（购自美国 Abbiotec公司）、Calcitonin Gene Related Peptide Fragment 8-37（购自美国Sigma-Aldrich公司），白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α） 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA） 定量检测试剂盒（购自美国R&D公司）；其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

酶联免疫检测仪、Power PacTM电泳仪、Transblot电转仪及凝胶成像系统Chemi Doc XRS（购自美国BIO-RAD公司），倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 VSMCs培养与鉴定雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡消毒5 min，用弯镊剥离主动脉，去除主动脉外膜，用剪刀剪碎为1 mm3大小组织块，用PBS冲洗2次以去除血细胞，然后将其均匀置于培养皿瓶底，加入10%FBS的DMEM完全培养基，培养5 d，至皿底铺满后进行传代培养。

1.3.2 VSMCs分组培养与处理第3代的VSMCs在37℃、50 ml/L二氧化碳CO2条件下，置于含10%FBS的DMEM完全培养基中贴壁培养，隔天换液。当细胞长至培养皿80%时，用含0.05%胰酶-EDTA溶液进行细胞消化传代，接种于培养板上，接种细胞密度 2×104～4×106个 /ml，培养 24 h后，进行分组实验。实验分为4组：①对照组（control）：不作任何处理；②LPS处理组：使用1 000 ng/ml LPS处理心肌细胞8 h；③CGRP组：给予100 nmol/L CGRP处理8 h；④LPS+CGRP组：给予1 000 ng/ml LPS和100 nmol/L CGRP处理8 h；⑤LPS+CGRP+C8-37组；给予100 nmol/L CGRP和1 μmol/L的CGRP受体拮抗剂C8-37同时处理8 h。

1.3.3 细胞免疫荧光鉴定VSMCs细胞表型将灭菌的细胞爬片放入24孔培养板中，然后以2×104～5×104个/ml细胞密度将VSMCs接种至爬片上，培养48h后用PBS洗涤细胞，之后加入4%多聚甲醛固定10min，用PBS漂洗3次，1%Trixon-100通透细胞10 min，PBS漂洗3次，5%BSA室温封闭30 min，加入一抗（α-SM-actin），放置4℃孵育过夜。PBS洗涤3次，加入二抗Cy3，37℃孵育1 h。PBS洗涤3次，DAPI（1∶1 000）孵育10 min，PBS洗涤3次，封片剂封片，荧光显微镜观察。

1.3.4 炎症因子的ELISA检测细胞培养于含有10%FBS的DMEM/培养基中，按照3×106个/ml的细胞密度种植于96孔板内，培养24 h后，进行分组细胞刺激处理。细胞处理结束后，收集培养基上清进行ELISA检测。按照IL-1β和TNF-α检测试剂盒的操作步骤进行ELISA检测。使用酶标仪于450 nm处测各孔OD值，每个样本重复3个复孔。然后绘制标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。最后取平均值进行统计学分析。

1.3.5 免疫印迹法（Western blot）检测提取细胞总蛋白，测定蛋白含量。以50 μg/每孔道的蛋白上样量进行SDS-PACE电泳，然后半干转将蛋白转移到PVDF膜上，于50 g/L的脱脂奶粉TBST溶液中室温封闭120 min，然后分别加入1∶1 000兔抗TLR4、IκBa、p-IκBa、p-p65、p65 及 α-Tubulin，4℃振摇孵育过夜。TBST洗膜10 min×3次，加入HRP二抗（1∶5 000）室温振摇孵育120 min，洗膜。然后加入ECL试剂发光，采用Image-Pro Plus 6.0软件进行数据分析靶蛋白的相对表达水平。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VSMCs的鉴定

原代VSMCs接种48 h后，在显微镜下呈梭形或不规则扁平状细胞。α-SM-actin免疫荧光染色结果显示95%以上细胞均为α-SM-actin蛋白（红色）。见图1。

图1 免疫荧光检测VSMCs标志物α-SM-actin（标尺=50μm）

2.2 LPS诱导下炎症因子IL-1β和TNF-α表达变化

经 0、10、100 及 1 000 ng/ml LPS 诱导 VSMCs细胞的炎症反应，各组IL-1β和TNF-α表达比较，经方差分析，差异有统计学意义（见表1）；随着LPS浓度的增加，IL-1β和TNF-α表达成梯度上升，并于1 000 ng/ml时分泌水平最高（P＜0.05）。使用1 000 ng/ml浓度的LPS在不同时间处理VSMCs，观察IL-1β和TNF-α表达水平随作用时间的变化，经方差分析，差异有统计学意义（见表2）。LPS在作用4 h后，IL-1β和TNF-α表达逐渐增加，在8 h时达到峰值，随后逐渐降低（P＜0.05）。

表1 不同LPS浓度诱导下炎症因子IL-1β和TNF-α表达水平的比较 （pg/ml，±s）

表1 不同LPS浓度诱导下炎症因子IL-1β和TNF-α表达水平的比较 （pg/ml，±s）

因子 0 ng/ml 10 ng/ml 100 ng/ml 1 000 ng/ml F值 P值IL-1β 35.000±2.887 49.236±2.309 64.667±4.372 97.667±7.623 31.930 0.000 TNF-α 221.333±25.075 389.667±11.141 484.667±10.990 646.667±34.954 60.434 0.000

表2 不同作用时间LPS浓度诱导下炎症因子IL-1β和TNF-α表达变化 （pg/ml，±s）

表2 不同作用时间LPS浓度诱导下炎症因子IL-1β和TNF-α表达变化 （pg/ml，±s）

LPS作用时间 IL-1β TNF-α 0 h 32.667±2.901 242.667±4.485 2 h 42.333±2.028 316.333±10.990 4 h 64.334±8.021 457.334±12.991 8 h 99.667±8.762 642.000±20.133 12 h 72.667±4.726 570.000±24.333 24 h 62.000±2728 547.000±14.640 F值 27.719 95.291 P值 0.000 0.000

2.3 外源CGRP剂量依赖性降低LPS诱导IL-1β和TNF-α的表达

与 0 ng/ml组比较，1 000 ng/ml LPS能增加VSMCs释放炎症因子IL-1β和TNF-α，但同时给予0、0.1、10、100 及 1 000 nmol/L 的 CGRP 预处理后，各组IL-1β和TNF-α表达比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；随着CGRP浓度的上升，LPS诱导IL-1β和TNF-α呈浓度依赖性降低，并于100 nmol/L时达到低峰点（P＜0.05）。见表3。

表3 CGRP剂量依赖性降低LPS诱导IL-1β和TNF-α的表达 （pg/ml，±s）

表3 CGRP剂量依赖性降低LPS诱导IL-1β和TNF-α的表达 （pg/ml，±s）

因子 0 nmol/L 0.1 nmol/L 10 nmol/L 100 nmol/L 1 000 nmol/L F值 P值IL-1β 97.667±7.623 96.667±7.535 78.000±1.528 65.124±2.309 79.667±2.646 11.379 0.001 TNF-α 642.032±20.133 622.315±19.053 542.101±11.790 371.667±17.786 515.534±18.818 49.179 0.000

2.4 CGRP拮抗剂对 VSMCs分泌 IL-1β 和TNF-α的影响

给予CGRP拮抗剂后，各组IL-1β和TNF-α表达比较，经方差分析，差异有统计学意义（IL-1β：F=39.339，P=0.000；TNF-α：F=87.166，P=0.000）；与对照组比较，1 000 ng/ml LPS引起VSMCs IL-1β和TNF-α的增加（P＜0.05），而单独给予CGRP预处理后，并未改变IL-1β和TNF-α的表达（P＞0.05）；但是在LPS基础上同时给予CGRP预处理后，却能抑制LPS引起的细胞内IL-1β和TNF-α表达的增加（P＜0.05）；而与 LPS+CGRP组比较，添加 CGRP的抑制剂C8-37能拮抗CGRP的该作用（P＜0.05）。见图2。

图2 CGRP抑制LPS诱导VSMCs内IL-1β和TNF-α的表达

2.5 CGRP对VSMCs分泌TLR4的影响

Western blot检测比较各组TLR4的表达差异，经方差分析，差异有统计学意义（F=170.026，P=0.000）。与对照组比较，LPS增加VSMCs TLR4的积累（P＜0.05），单独给予CGRP预处理，对TLR4蛋白表达未影响（P＞0.05）；但同时给予（LPS+GRP）预处理后，却能抑制LPS引起的细胞内TLR4蛋白表达的增加（P＜0.05）；而CGRP的抑制剂C8-37却又能拮抗CGRP对TLR4的抑制作用（P＜0.05）。见图3。

图3 CGRP抑制LPS诱导的VSMCs内TLR4的积累

2.6 CGRP抑制LPS诱导的VSMCs IκBa和 p65的磷酸化

Western blot检测比较各组IκBa和p65的活化差异，经方差分析，差异有统计学意义（IκBa：F=116.188，P=0.000；p65：F=88.403，P=0.000）。与对照组比较，LPS 激活 VSMCs IκBa and NF-κB p65 的磷酸化（P＜0.05），而单独给予 CGRP 预处理，对 IκBa磷酸化无明显作用（P＞0.05），但却抑制p65的磷酸化水平（P＜0.05）；但同时给予（LPS+CGRP）预处理后，更进一步抑制LPS促进的细胞内IκBa和p65蛋白磷酸化（P＜0.05）；而CGRP的抑制剂C8-37却又能拮抗CGRP对 IκBa和p65的抑制作用（P＜0.05）。见图4。

图4 CGRP抑制LPS诱导的VSMCs内IκBa和p65磷酸化

3 讨论

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性血管疾病，它由多种因素共同诱导作用形成，在其发展过程中，VSMCs发生表型转换，由收缩静止型变为增殖迁移型细胞，分泌细胞外基质，激活炎症信号，而且释放炎症细胞因子和趋化因子，进而与浸润炎症细胞相互作用，最终促进炎症和病变[1，6]。

CGRP是一种广泛分布于神经和心血管系统的血管活性肽，其分布与血管紧密联系，在血管中CGRP的含量高于心脏。生理条件下，CGRP与降钙素受体样受体/受体活性修饰蛋白1（receptor activity modifying protein 1，RAMP1）组成的复合受体结合才能发挥作用[7]。本研究显示，CGRP涉及神经类疾病，如三叉神经和偏头痛等[8]，并在心血管的自我稳态调节和血管结构中具有关键调节作用[9-10]。KROEGER等研究显示，在肝脏中，CGRP还能通过减少促炎症介质富集而发挥抗炎症作用[11]。但是CGRP对VSMCs炎症的作用，却尚不明确。

本研究首先通过LPS刺激建立VSMCs炎症模型[12]，观察CGRP对LPS诱导的VSMCs炎症因子IL-1β和TNF-α表达表达的影响。结果显示，与对照组比较，随着LPS浓度的增加，IL-1β和TNF-α表达成梯度上升，并于1 000 ng/ml LPS作用8 h时，炎症因子IL-1β和TNF-α表达达到峰值（P＜0.05）。单独给予CGRP预处理后，并未改变IL-1β和TNF-α的表达；但是在LPS基础上同时给予CGRP预处理后，却能抑制LPS引起的细胞内IL-1β和TNF-α表达的增加（P＜0.05）；而CGRP的抑制剂C8-37能拮抗CGRP的该作用（P＜0.05），以上结果表明，CGRP能够抑制LPS诱导的VSMCs炎症因子IL-1β和TNF-α表达，从而抑制细胞炎症反应。

大量研究证实，LPS可以与TLR4受体相结合，激活NF-κB，引起炎症介质和细胞因子的表达，起到抗免疫调节的作用[13-15]。但CGRP是否能通过TLR4/NF-κB信号通路，抑制细胞因子和炎症介质的释放，抵抗LPS介导的VSMCs炎症反应呢？本实验结果证实，CGRP通过阻断LPS诱导的细胞内TLR4的积累，抑制NF-κB信号蛋白IκBa与p65蛋白激活，削弱细胞炎症因子IL-1β和TNF-α的表达，从而抑制VSMCs的炎症激活反应。

本研究显示，CGRP通过抑制TLR4积累和NF-κB信号蛋白IκBa与p65的活性，进而削弱LPS诱导的细胞炎症因子IL-1β和TNF-α的上调，抑制LPS诱导的VSMCs炎症的激活，发挥抗炎作用，这为以慢性炎症为主要发病机制的动脉粥样硬化的防治提供新的靶点和治疗策略。但本研究也存在一定局限性，对CGRP与TLR4和NK-κB上下游信号通路之间的关系，还不深入，仍需进一步研究。

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Effect of CGRP on lipopolysaccharide-induced expressions of TLR4/NK-κB and inflammatory factors of vascular smooth muscle cells*

Fang Wang1,Xiang-qun Zhou1,Jie Fu2
(1.Department of Cardiology,the Third People's Hospital of Hainan Province,Sanya,Hainan 572000,China;2.Department of Histology and Embryology,Xinxiang Medical College,Xinxiang,Henan 453003,China)

R685.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.003

1005-8982（2017）21-0012-06

2017-02-28

海南省卫生厅课题（No：1421320.24A1004）