布地奈德联合辛伐他汀对慢性阻塞性肺疾病大鼠炎症因子与肺组织病理的影响*

刘晓姝，郭璐

（四川省医学科学院·四川省人民医院 呼吸内科，四川 成都 610072）

布地奈德联合辛伐他汀对慢性阻塞性肺疾病大鼠炎症因子与肺组织病理的影响*

刘晓姝，郭璐

（四川省医学科学院·四川省人民医院 呼吸内科，四川 成都 610072）

目的探讨布地奈德联合辛伐他汀对慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠模型炎症因子与肺组织病理的影响，为药物干预方案提供实验依据。方法根据不同的药物干预方案将COPD大鼠分为模型组（M组）、布地奈德组（BD组）、辛伐他汀组（SV组）及布地奈德联合辛伐他汀组（BD+SV组），比较不同组别COPD大鼠血清和支气管肺泡灌洗液（BLAF）中的白细胞介素 6（IL-6）、白细胞介素 8（IL-8）、白三烯 B4（LTB4）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平及肺组织病理的改变。结果血清炎症因子水平：BD组IL-6、TNF-α，SV组IL-6，（BD+SV）组 IL-6、IL-8及 TNF-α 分别较 M组降低（均P＜0.05）；（BD+SV）组 IL-8水平较 SV 组下降（P＜0.05）。BALF 炎症因子水平：BD 组 IL-6、IL-8，SV 组 IL-6、TNF-α，（BD+SV）组 IL-6、IL-8、LTB4 及 TNF-α 水平分别较M组降低（均P＜0.05）。（BD+SV）组BALF中IL-8、LTB4及TNF-α水平较BD组降低，IL-8、LTB4水平较SV组下降（均P＜0.05）。BD组、SV组、（BD+SV）组肺组织病理半定量评分较M组降低（均P＜0.05），病理均显示肺气肿囊腔变小、支气管炎症减轻。结论使用布地奈德联合辛伐他汀可以有效降低COPD大鼠全身和气道炎症反应，改善肺组织病理。

肺疾病；慢性阻塞性；炎症；布地奈德；辛伐他汀

Abstract:ObjectiveTo investigate synergistic effect of Budesonide and Simvastatin on cytokines and pulmonary histological injury in rat models of chronic obstructive pulmonary disease (COPD)so as to provide indications for novel pharmacological intervention.MethodsRats were randomly divided into model(M)group,Budesonide (BD)group,Simvastatin (SV)group and Budesonide combined with Simvastatin (BD+SV)group.Levels of interleukin6(IL-6),interleukin8(IL-8),leukotriene B4 (LTB4)and tumor necrosis factor alpha(TNF-α)in serum and bronchoalveolar lavage fluid (BALF)were measured.Histological injury was graded in rat lung slices.ResultsInflammatory cytokines in serum:compared with the M group,levels of IL-6 and TNF-α in the BD group,IL-6 in the SV group,and IL-6,IL-8 and TNF-α in the BD+SV group were decreased (P＜0.05).The level of IL-8 was attenuated in the BD+SV group compared with those in the SV group (P＜0.05).Inflammatory cytokines in BALF:the levels of IL-6 and IL-8 in the BD group,IL-6 and TNF-α in the SV group,and IL-6,IL-8,LTB4 and TNF-α in the BD+SV group were reduced compared with those in the M group(P＜0.05).Levels of IL-8,LTB4 and TNF-α in the BD+SV group were decreased in comparison with those in the BD group.Levels of IL-8 and LTB4 could be diminished by BD+SVtreatment when compared with the SV group (P＜0.05).Semi-quantitative scores of pathological changes of lung tissues in the BD group,the SV group and the BD+SV group were lower than those in the M group(P＜0.05),the lung tissues showed reduced cyst cavities and alleviated bronchitis.ConclusionsBudesonide combined with Simvastatin could synergistically relieve systematic and airway inflammation,and attenuate histological injury in the lungs of COPD rat models.

Keywords:chronic obstructive pulmonary disease;inflammation;Budesonide;Simvastatin

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一种以气道和全身炎症为特征的疾病[1]，死亡率高且不断增长，预计到2020年将成为世界第3大死因，因此需积极干预，以控制症状、减少急性加重和降低死亡率。在COPD稳定期的治疗中，吸入性糖皮质激素（inhaled corticosteroid，ICS）能减少气道和全身炎症，减少COPD急性加重次数[2]。他汀类药物在关于COPD的观察性研究中，与减慢肺功能下降、降低COPD急性加重发生率、死亡率有关[3-4]；亦有报道他汀可增加ICS的局部抗炎作用[5]，两者联合可改善COPD临床症状[6-7]，但证据较少。本研究使用布地奈德联合辛伐他汀干预COPD大鼠模型，观察其血清和支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中炎症因子表达量和肺组织病理的改变，探讨ICS联合他汀对COPD大鼠炎症的影响及是否存在协同作用和联合应用的可能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Wistar大鼠，180～200 g，全为雄性，无特定病原体级（specific pathogen free，SPF）（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），脂多糖（LPS）（购自SIGMA公司，批号L2880-10，10 mg/支），娇子（时代阳光）牌香烟（购自四川省成都川渝中烟工业公司，焦油量：12 mg），辛伐他汀片（购自美国默沙东制药有限公司），吸入用布地奈德混悬液（购自英国阿斯利康制药有限公司）。

1.2 仪器与设备

自制有机玻璃烟熏箱80 cm×60 cm×50 cm，Hamilton微量进样器，鱼跃超声雾化器402AI（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司）；Riester LED光纤检耳镜（中国Aglaia healthcare公司），生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司），Bio-Road公司酶标仪（上海科华实验系统有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型复制45只SPF级大鼠，适应性饲养10d后随机分为模型组（M组）、布地奈德组（BD组）、辛伐他汀组（SV组）及布地奈德联合辛伐他汀组（BD+SV）组4组，每组15只。M组处理方案参照文献[8]，烟熏时间共计 60 d；BD 组、SV 组、（BD+SV）组烟熏、滴注LPS同M组。BD组：试验第15天开始雾化吸入布地奈德气雾剂0.5 mg，每次15 min，2次/d；SV组：试验第15天开始，每日烟熏前，给予辛伐他汀（5 mg/kg）灌胃，1次/d；（BD+SV）组：试验第15天开始加用辛伐他汀（5 mg/kg），1次/d灌胃治疗，雾化吸入布地奈德气雾剂0.5 mg，15 min/次，2次/d。饲养过程中观察行为学变化淘汰异常大鼠。

1.3.2 血清检测实验第60天，称重所有大鼠，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后将大鼠仰卧固定于操作台，分离腹主动脉，抽取动脉血5 ml，离心分离血清，Elisa法测定血清白细胞介素 6（interleukin，IL-6）、白细胞介素 6（interleukin，IL-8）、白三烯 B4（Leukotriene B4，LTB4）和肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）含量。

1.3.3 BALF检测切开暴露胸部，结扎右主支气管，于隆突上用套管针穿刺至左肺，以2 ml生理盐水灌洗，缓慢回抽，每次回收约1.5 ml，反复灌洗3次，回收率要求达到75%，混匀灌洗液，离心后取上清液Elisa法测 IL-6、IL-8、LTB4及 TNF-α 浓度。

1.3.4 肺组织观察取新鲜右肺下叶组织，经10%中性福尔马林固定48 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续4 μm切片4张，HE染色，光镜下观察右肺下叶病理改变并进行半定量分析。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，应用单因素方差分析，若方差齐则两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清炎症因子水平比较

各组大鼠血清炎症因子中LTB4水平差异无统计学意义（F=1.185，P=0.329），IL6、IL-8 及 TNF-α水平差异有统计学意义（F=6.826、7.212及5.329，P=0.001、0.001及0.004）。与M组比较，BD组血清炎症因子IL-6、TNF-α水平降低，SV组IL-6降低，BD+SV组IL-6、IL-8及TNF-α水平降低（均P＜0.05），差异有统计学意义；与BD组比较，BD+SV组血清炎症因子IL-6、IL-8、LTB4及TNF-α水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与SV组比较，BD+SV组血清炎症因子IL-8水平降低（P＜0.05），差异有统计学意义。见表1。

表1 不同组别COPD大鼠血清炎症因子水平比较（ng/L，±s）

表1 不同组别COPD大鼠血清炎症因子水平比较（ng/L，±s）

组别 例数 IL-6 IL-8 LTB4 TNF-α M 组 9 3.8±0.2 167.6±13.0 358.5±23.9 129.4±8.7 BD 组 10 3.4±0.4 164.0±6.5 379.3±29.3 120.4±4.8 SV 组 10 3.4±0.3 175.0±11.5 376.6±25.5 122.3±4.4 BD+SV 组 11 3.2±0.3 154.1±10.0 357.0±10.7 118.5±6.7 F值 6.826 7.212 1.185 5.329 P值 0.001 0.001 0.329 0.004

2.2 各组大鼠BALF中炎症因子水平比较

各组大鼠BALF炎症因子水平中，IL-6、IL-8、LTB4及TNF-α水平差异有统计学意义（F=4.249、13.437、7.693 及 8.436，P=0.011、0.000、0.000 及 0.001）。与M组比较，BALF中炎症因子BD组IL-6、IL-8水平减低，SV组 IL-6、TNF-α 水平降低，BD+SV组IL-6、IL-8、LTB4及 TNF-α 水平降低（均P＜0.05），差异有统计学意义。与BD组比较，BD+SV组IL-8、LTB4、TNF-α 降低（均P＜0.05），差异有统计学意义。与SV组比较，BD+SV组BALF中IL-8、LTB4水平降低（均P＜0.05），差异有统计学意义。见表2。

表2 不同组别COPD大鼠BALF中炎症因子水平比较（ng/L，±s）

表2 不同组别COPD大鼠BALF中炎症因子水平比较（ng/L，±s）

组别 例数 IL-6 IL-8 LTB4 TNF-α M 组 9 10.7±1.7 97.1±8.4 196.3±17.6 46.0±3.5 BD 组 10 9.1±0.8 88.8±5.1 192.6±12.1 43.0±3.2 SV 组 10 9.0±0.4 92.0±4.6 182.7±12.1 41.7±3.8 BD+SV 组 11 9.1±1.2 81.1±5.0 172.1±13.8 38.1±2.8 F值 4.249 13.437 7.693 8.436 P值 0.011 0.000 0.000 0.001

2.3 肺组织光镜观察

2.3.1 各组大鼠肺组织病理M组大鼠肺组织可见支气管纤毛柱状上皮细胞部分剥脱，纤毛粘连倒伏，杯状细胞增生，黏膜下层炎性细胞浸润，支气管平滑肌增厚，管腔内充满中性粒细胞、肺泡巨噬细胞及粘液分泌物，终末细支气管远端狭窄，呼吸细支气管及肺泡管囊状扩张，有肺气肿和肺大疱形成。BD组、SV组、BD+SV组大鼠肺组织上皮结构完整，可见部分支气管纤毛，肺泡结构完整，部分肺泡壁变薄，肺泡腔扩大，但较M组肺气肿囊腔可见变小、各级支气管炎症可见减轻。见附图。

2.3.2 各组大鼠肺组织病理半定量评分比较各组大鼠肺组织病理半定量评分差异有统计学意义（F=4.382，P=0.010）。与M组比较，BD组、SV组及BD+SV组肺组织病理半定量评分降低，差异有统计学意义（均P＜0.05）；BD组、SV组及BD+SV组3组间两两比较肺组织病理半定量评分差异无统计学意义。见表3。

附图 不同组别大鼠肺组织病理比较 （HE×100）

表3 不同组别大鼠肺组织病理半定量评分比较 （±s）

表3 不同组别大鼠肺组织病理半定量评分比较 （±s）

组别 例数 肺组织病理半定量评分M组 9 2.0±0.7 BD组 10 1.2±0.4 SV组 10 1.4±0.5 BD+SV组 11 1.2±0.4 F值 4.382 P值 0.01

3 讨论

感染、氧化应激和蛋白酶/抗蛋白酶的失衡等因素引起IL-6、IL-8、LTB4及TNF-α等多种炎症介质的释放，刺激中性粒细胞和巨噬细胞等炎症细胞活化、聚集，造成COPD患者气道、肺实质和血管持续炎症状态，导致COPD急性加重的发生和肺功能降低。因此，下调COPD炎症反应在COPD的治疗中是一项重要环节。COPD的药物干预措施中，布地奈德具有抗炎抗过敏作用，通过阻断花生四烯酸代谢和减少白三烯与前列腺合成解除支气管平滑肌痉挛，减缓呼吸道症状的进展[9-10]；辛伐他汀为羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，降脂保护血管功效外还具有抗炎和调节免疫的作用，近年来较多证据支持其能降低COPD急性加重次数和死亡率[11-13]。布地奈德联合辛伐他汀能否对COPD炎症反应起到协同干预作用，目前尚无相关探讨。

在参与COPD的炎性介质中，IL-6是具有多种生物功能的炎症细胞因子，其参与气道炎症的发生、发展过程[14]，导致COPD患者气道粘液高分泌和气道重塑；IL-8是主要的炎症细胞趋化因子，亦可引起炎症细胞的活化和氧自由基的释放，损伤肺泡上皮细胞和微血管，其水平高低与COPD的临床结局呈正相关性[15]；LTB4是选择性中性粒细胞趋化剂，可导致支气管壁黏膜炎症细胞浸润增多而进一步扩大局部炎症反应[16]；TNF-α是炎症进程、免疫应答以及宿主防御系统的关键介质，并参与肺气肿的形成和上皮细胞损伤[17]。研究结果显示，相比BD组或SV组仅存在少数或个别血清炎症因子水平的降低，BD+SV组血清中IL-6、IL-8和TNF-α水平均出现降低，尤其观察到IL-8下降的水平较SV组更低，说明布地奈德联合辛伐他汀能有效抑制COPD大鼠由IL-6、IL-8及TNF-α介导的全身炎症反应，且对COPD发病机制起关键作用的IL-8下调幅度较使用辛伐他汀组更大，分析布地奈德联合辛伐他汀不仅发挥各自抗炎、抗氧化作用外还有协同效应。已有研究显示，辛伐他汀通过增加IL-10的表达增强ICS的抗炎效应[5]，并能减少ICS使用后的急诊事件[18]；而ICS亦可增加COPD患者使用他汀类药物的益处，两者联合有利于改善COPD患者预后。

布地奈德联合辛伐他汀在下调气道局部炎症水平方面更具优势，BD+SV组大鼠出现BALF中，IL-6、IL-8、LTB4及TNF-α的水平全面降低，其中，IL-8、LTB4及TNF-α水平较BD组，IL-8、LTB4水平较SV组下降，提示布地奈德联合辛伐他汀较两药分别单用在下调气道局部炎症方面更突出、效应更广泛，进一步证实两种药物抗炎、抗氧化和免疫调节作用外还有协同效应。病理观察到BD组、SV组、BD+SV组肺气肿囊腔变小、支气管炎症减轻，肺组织病理半定量评分降低，说明3种治疗方案干预COPD大鼠后肺组织炎症均得到一定程度的改善，但3组间肺组织病理半定量评分无差异，分析与病理改变滞后于炎症反应以及实验观察周期较短有关。

综上所述，布地奈德联合辛伐他汀既可降低COPD大鼠全身炎症反应水平，又可广泛的下调COPD大鼠气道局部炎症，两药联合具有协同抗炎作用，进而推测ICS联合他汀可从抑制炎症介质角度使COPD患者受益，可考虑作为COPD患者稳定期的干预措施。该研究不足之处，观察周期短，未能观察到病死率、肺功能的改善，需要大规模、多中心、随机双盲的临床实验以进一步证实。

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Synergistic effect of Budesonide and Simvastatin on cytokines and lung histological injury in rat models of COPD*

Xiao-Shu Liu,Lu Guo
(Department of Respiratory Medicine,Sichuan Provincial People's Hospital,Sichuan Academy of Medical Sciences,Chengdu,Sichuan 610072,China)

R563.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.21.002

1005-8982（2017）21-0007-05

2017-03-20

四川省科技厅基础研究计划项目（No：2013JY0177）

郭璐，E-mail：18981838226@163.com；Tel：18981838226