不同人乳腺癌细胞系中程序性死亡-配体1的表达*

汪新茹，李朵璐，杨 盟，姜东宝，张雅迪，阚全程#

1)郑州大学第一附属医院药学部 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院胃肠外科 郑州 450052

不同人乳腺癌细胞系中程序性死亡-配体1的表达*

汪新茹1)，李朵璐1)，杨 盟1)，姜东宝2)，张雅迪1)，阚全程1)#

1)郑州大学第一附属医院药学部 郑州 450052 2)郑州大学第一附属医院胃肠外科 郑州 450052

程序性死亡-配体1；乳腺癌

目的：探讨程序性死亡-配体1(PD-L1)在不同人乳腺癌细胞系中的表达情况。方法采用Western blot法和实时荧光定量PCR法检测PD-L1蛋白及mRNA在人乳腺细胞株HBL-100及4种乳腺癌细胞株MCF-7、MCF-7/ADR、MDA-MB-231、MDA-MB-468中的表达情况。结果与人乳腺细胞HBL-100相比，PD-L1在MDA-MB-231、MDA-MB-468及MCF-7/ADR中均呈较高水平的表达(P<0.05)，在MDA-MB-231中表达水平最高(P<0.001)。结论PD-L1主要表达于人乳腺癌细胞中。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一[1]。目前,乳腺癌已经成为我国女性发病位居首位的恶性肿瘤[2]。国外研究[3]表明程序性死亡-配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)在正常乳腺组织中几乎不表达，主要表达于乳腺癌组织中。大多数文献报道中使用免疫组化方法研究乳腺癌组织中PD-L1的表达情况，对乳腺癌细胞中PD-L1表达的研究甚少。该研究采用Western blot技术和实时荧光定量PCR技术观察不同人乳腺癌细胞中PD-L1的表达情况，以进一步研究PD-L1在乳腺癌中的表达及意义。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器DMEM高糖双抗培养基、RPMI 1640双抗培养基购自索莱宝公司，胎牛血清(FBS)购自美国Clark公司，胰蛋白酶细胞消化液购自上海碧云天生物技术有限公司。Tripure Reagent、FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)购自美国Roche公司，cDNA第一链合成试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，引物合成交由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。兔抗人PD-L1多克隆抗体及兔抗人GAPDH单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，IRDye 800CW山羊抗兔IgG(H+L)荧光二抗购自美国LI-COR公司，BCA蛋白定量试剂盒、WB一抗及二抗稀释液购自武汉博士德生物工程有限公司，NuPAGE®MOPS SDS Running Buffer(20×)、NuPAGE®Transfer Buffer(20×)、WesternBreeze®Blocker/Diluent(Part A and B)购自美国Thermo Fisher Scientific公司；BioTraceTMNT Pure Nitrocellulose Blotting Membrane(NC膜)购自美国Pall Life Sciences公司。超净工作台购自珠海市再鑫仪器有限公司，StepOnePlusTMReal-Time PCR System购自美国Applied BiosystemsTM，CO2培养箱、电泳仪XCell SureLock®Mini-Cell CE mark、微量分光光度计NanoDrop 2000、高速冷冻离心机Heraeus Fresco 17购自美国Thermo Fisher Scientific公司，Odyssey红外荧光扫描成像系统购自美国LI-COR公司。

1.2细胞培养人乳腺细胞株HBL-100及乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468由郑州大学第一附属医院临床药学(免疫)重点实验室提供；乳腺癌细胞株MCF-7/ADR购自赛百慷(上海)生物技术有限公司。HBL-100、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468在含体积分数10% FBS、100 U/mL青霉素和0.1 g/L链霉素的DMEM高糖双抗培养基中，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于后续实验。MCF-7/ADR在含体积分数20% FBS、100 U/mL青霉素和0.1 g/L链霉素的RPMI 1640双抗培养基中，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中进行培养，当大部分细胞贴壁后更换含1 μmol/L阿霉素的新鲜完全培养基继续培养，取对数生长期的MCF-7/ADR用于后续实验。

1.3各细胞PD-L1mRNA的实时荧光定量PCR检测提取各细胞样品RNA，检测浓度与纯度后-80 ℃冰箱保存备用。RNA通过反转录得到cDNA。在StepOnePlusTMReal-Time PCR System上进行PCR反应。PCR引物序列见表1。

表1 引物序列

反应体系:10 μL FastStart Universal SYBR Green Master(ROX), 10 μmol/L的上下游引物各0.8 μL，1 μL cDNA，灭菌用ddH2O 7.4 μL。扩增条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法分析PD-L1 mRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.4各细胞PD-L1蛋白的Westernblot检测取汇合率达80%左右的细胞，提取蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取30 μg蛋白，总体积20 μL上样，利用SDS-PAGE预制胶110 V电泳100 min分离目的蛋白，转移至NC膜上。剪下目的条带，用Blocker/Diluent A和B室温封闭1 h。加入兔抗人PD-L1多克隆抗体(按11 000稀释)及兔抗人GAPDH单克隆抗体(按11 000稀释)，4 ℃孵育过夜。第2天，TBST洗3遍，每次5 min。加入荧光二抗IRDye 800CW山羊抗兔IgG(H+L)(按15 000稀释)，室温孵育1 h。TBST洗3遍，每次5 min，最后用ddH2O漂洗蛋白膜后，置Odyssey红外荧光扫描成像系统中扫描，利用Image Studio Version 2.0.38软件对图像进行灰度分析。以PD-L1与GAPDH条带灰度值的比值作为PD-L1蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.5统计学处理使用SPSS 21.0处理数据。采用单因素方差分析比较5种细胞中PD-L1 mRNA和蛋白表达水平的差异，组间两两比较用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

各细胞PD-L1 mRNA和蛋白的表达情况见图1、表2。与人乳腺细胞HBL-100相比，PD-L1在MDA-MB-231、MDA-MB-468及MCF-7/ADR中均呈现较高水平的表达，且MDA-MB-231中表达最高。

1:HBL-100；2:MCF-7；3:MCF-7/ADR；4:MDA-MB-231；5:MDA-MB-468。 图1 5种细胞Western blot实验结果

细胞nmRNA蛋白HBL-10031.010±0.1770.0019±0.0010MCF-730.349±0.0800.0007±0.0005MCF-7/ADR312.828±3.709*0.0093±0.0046*MDA-MB-468315.135±0.821*0.0070±0.0067MDA-MB-231321.823±6.032*0.0167±0.0064*F(P)25.650(<0.001)9.019(0.002)

*:与HBL-100相比，P<0.05。

3 讨论

目前，治疗乳腺癌主要是采用包括手术治疗、化学治疗、放射治疗、内分泌治疗、生物治疗、中医中药治疗在内的综合治疗方式[1，4-5]。分子免疫治疗是一种具有临床应用前景的新型治疗途径，可以利用机体自身免疫系统识别和摧毁肿瘤细胞，防止乳腺癌的复发和病灶的转移[6]。现在使用肿瘤靶向单克隆抗体的被动免疫治疗已经获得广泛的治疗效果[7]，但是T细胞定向的主动免疫治疗却收效甚微[8]。PD-L1是PD-1的主要配体[9]，高表达于多种造血系统和非造血系统肿瘤细胞表面，包括黑色素瘤、胶质瘤、肺癌、肾癌、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、胰腺癌等[10-11]，可作为分子免疫治疗的新靶点，诱导阻断PD-1/PD-L1信号通路可以抑制T细胞的免疫活性并且限制肿瘤细胞死亡[12]。

Soliman等[13]将不同乳腺癌细胞系分为管腔型和基底型进行相关研究，结果表明基底型乳腺癌细胞(包括BT-20、HCC1143、MDA-MB-231及HCC38)持续高表达PD-L1，其中基底B型乳腺癌细胞(MDA-MB-231及HCC38)PD-L1表达量最高。CCLE数据库亦显示PD-L1 mRNA在基底型细胞如MDA-MB-231、MDA-MB-468中的表达水平高于非基底型细胞如MCF-7[13]。该研究结果显示PD-L1在MCF-7/ADR、MDA-MB-468及MDA-MB-231细胞中的表达水平升高，尤其是在MDA-MB-231细胞中，但在MCF-7中表达水平较低，与上述研究结果相一致，但并没有文献报道过PD-L1在MCF-7/ADR细胞也有较高水平的表达。这为今后进一步研究PD-L1在不同乳腺癌组织中表达情况及其与乳腺癌患者预后关系奠定了一定的实验基础。

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(2016-11-15收稿 责任编辑徐春燕)

Expression of programmed death-ligand 1 in different human breast cancer cell lines

WANGXinru1),LIDuolu1),YANGMeng1),JIANGDongbao2),ZHANGYadi1),KANQuancheng1)

1)DepartmentofClinicalPharmacology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofGastrointestinalSurgery,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

programmed death-ligand 1;breast cancer

Aim: To investigate the expression of programmed death-ligand 1(PD-L1) in different human breast cancer cell lines. Methods: Using Western blot and fluorescence quantitative PCR, we detected the protein and mRNA expressions of PD-L1 in human breast epithelium cell line HBL-100 and the other 4 human breast cancer cell lines including MCF-7, MCF-7/ADR, MDA-MB-231, and MDA-MB-468.Results: Compared with HBL-100, PD-L1 had higher expression in MDA-MB-231, MDA-MB-468 and MCF-7/ADR cells(P<0.05), especially in MDA-MB-231 cells(P<0.001).Conclusion: PD-L1 is mainly expressed in breast cancer cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.021

*河南省高等学校重点科研项目 16A350003

R967

#通信作者，男，1963年9月生，博士，主任药师,教授，研究方向：临床药学免疫，E-mail：qckan19632012@163.com