野菊花保肝胶囊抗乙肝病毒及抗酒精性肝损伤的作用*

王振基，孟小倩，刘文亚，闫京花，许佳慧，徐丽华，毕跃峰

郑州大学药学院 郑州 450001

野菊花保肝胶囊抗乙肝病毒及抗酒精性肝损伤的作用*

王振基，孟小倩，刘文亚，闫京花，许佳慧，徐丽华，毕跃峰#

郑州大学药学院 郑州 450001

野菊花保肝胶囊；乙肝病毒；酒精性肝损伤；小鼠

目的：研究野菊花保肝胶囊(CBC)体外抗乙肝病毒及体内抗酒精性肝损伤的作用并初步探讨其作用机制。方法HepG2.2.15细胞分为9组，分别给予0.000、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000和80.000 mg/L的CBC处理72 h，采用CCK-8实验检测细胞增殖；HepG2.2.15细胞分为6组，分别用0.000、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/L CBC和100 mg/L拉米夫定处理，采用ELISA检测各组细胞第6天、第9天上清液中HBsAg、HBeAg的含量。将60只昆明小鼠随机分成正常对照组，模型组，联苯双脂滴丸组(BP阳性对照组，150 mg/kg)，CBC高、中、低剂量组(280、140、70 mg/kg)，每组10只，除正常对照组外，其余5组采用体积分数53%乙醇灌胃的方式建立小鼠急性酒精性肝损伤模型并给予相应处理，10 d后测定各组小鼠血清ALT、AST水平，以及肝组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平，并观察各组小鼠肝组织病理学变化。结果各给药组HepG2.2.15细胞第6、9天上清液中HBsAg、HBeAg的含量均降低(P<0.05)；CBC对HepG2.2.15的半数细胞毒浓度和最大无毒浓度分别为5.014、0.231 mg/L。CBC能显著降低酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性，升高肝组织SOD活性，降低MDA含量；CBC各给药组肝损伤症状减轻，尤其是CBC中、高剂量组(P<0.05)。结论CBC具有体外抗乙肝病毒作用，并对酒精性肝损伤有保护作用。

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的、以肝损伤为主的传染性疾病，是肝损伤最常见的原因[1]。目前临床主要的抗HBV药物有核苷类似物和干扰素，前者易产生耐药，后者易引起肝损伤等不良反应。我国传统中药以其多途径、多层次、多靶点、价格低廉、不良反应少等特点，逐渐成为抗HBV和肝保护的研究热点[2]。野菊花(FlosChrysanthemiindici)来源于菊科植物野菊的干燥头状花序，性微寒，味苦辛，归心肝二经，具有疏散风热、消肿解毒、抗感染、抗病毒的功效[3]。作者所在的课题组经过前期研究，从野菊花中获得一个具有抗乙肝病毒、肝保护作用的活性部位(主要成分包括黄酮类和倍半萜类)，并研制成野菊花保肝胶囊(CBC)[4-5]。该研究旨在检测CBC对HBV的抑制作用，及其对酒精性肝损伤小鼠的肝保护作用，报道如下。

1 材料与方法

1.1材料HepG2.2.15细胞株由郑州大学药学院王亚峰老师惠赠。SPF级昆明小鼠，体重(20±2) g，雌雄各半，由河南省实验动物中心提供。野菊花来自河南省信阳市大别山地区，标本保存于郑州大学药物研究院标本室，标本号201605。CBC由作者所在实验室自行制备。拉米夫定购于GSK公司，联苯双脂滴丸(BP)购于万邦德制药集团股份有限公司，RPMI 1640培养基购于Solarbio公司，胎牛血清购于美国Gibco公司，G418购于Thermo公司，HBsAg和HBeAg检测试剂盒购于上海科华生物工程股份有限公司，ALT、AST、MDA、SOD ELISA检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。倒置显微镜(上海光学仪器五厂)，细胞培养箱(Thermo公司)，超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，酶标仪(BioTek公司)，台式高速大容量冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司)，内切式组织匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2药物配制CBC各剂量组及拉米夫定溶液用双蒸水配制，并用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌；BP溶液用5 g/L的CMC-Na配制，4 ℃保存备用。

1.3CBC对HepG2.2.15细胞增殖的影响细胞常规培养至对数生长期，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，调整细胞密度为6×104mL-1，接种于96孔板，每孔100 μL，于CO2培养箱中培养24 h，加入含不同质量浓度(0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000和80.000 mg/L)CBC的培养基，每孔100 μL，同时设空白对照组，每个浓度设4个复孔，连续培养72 h。于实验结束前4 h，每孔加入5 μL CCK-8试剂孵育4 h，用酶标仪在450 nm处检测其吸光度。计算半数细胞毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。

1.4CBC对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响细胞常规培养至对数生长期，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，调整细胞密度为6×104mL-1，接种于96孔板，每孔100 μL，于CO2培养箱中培养24 h，加入含不同质量浓度(0.125、0.250、0.500、1.000 mg/L)CBC的培养基，每孔100 μL，同时设拉米夫定组(阳性对照组)(100 mg/L)和空白对照组，每个浓度设4个复孔，连续培养9 d，分别收集第6天和第9天的上清液，按照ELISA检测试剂盒的要求检测上清液中HBsAg、HBeAg的含量。

1.5CBC对酒精性肝损伤小鼠的肝保护作用取7周龄SPF级昆明小鼠60只，随机分成正常对照组，模型组，BP阳性对照组(150 mg/kg)，CBC高、中、低剂量组(280、140、70 mg/kg)，每组10只，雌雄各半。采用灌胃方式按0.2 mL/10 g体重给药，正常对照组和模型组给予等体积的双蒸水，1次/d，共10 d。末次给药禁食不禁水3 h后，模型组和给药组给予体积分数53%的乙醇(12 mL/kg)，正常对照组给予等体积的生理盐水，12 h后称重，摘眼球取血，分离血清用于检测ALT和AST；立即脱颈椎处死小鼠取出肝脏，制备10%肝组织匀浆，检测肝匀浆中MDA和SOD的含量；进行肝组织病理学检查，病理损伤分级标准参照文献[6]。

1.6统计学处理应用SPSS 20.0处理数据。采用单因素方差分析比较各组细胞间的吸光度值，上清液中HBsAg和HBeAg含量的差异，以及各组小鼠血清ALT、AST活性和肝组织MDA、SOD含量的差异，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1CBC对HepG2.2.15细胞的毒性作用0.000(空白对照)、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000和80.000 mg/L的CBC处理HepG2.2.15细胞72 h后，吸光度值分别为(1.131±0.054)、(1.096±0.010)、(0.937±0.049)、(0.671±0.064)、(0.567±0.121)、(0.323±0.163)、(0.199±0.013)、(0.188±0.015)和(0.180±0.008)，随着浓度的增加，吸光度值减小(F=15.052，P=0.002)；TC50和TC0分别为5.014、0.231 mg/L。

2.2CBC对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响CBC对HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg的分泌均有抑制作用。见表1。

表1 CBC对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响(n=4)

*：与空白对照组比较，P<0.05。

2.3CBC对酒精性肝损伤小鼠血清ALT和AST活性的影响模型组小鼠血清ALT、AST活性较正常对照组升高，而CBC各剂量组ALT和AST活性较模型组不同程度地降低。见表2。

2.4CBC对酒精性肝损伤小鼠肝组织MDA、SOD含量的影响模型组小鼠肝组织MDA含量较正常对照组升高，SOD含量降低；CBC高剂量组MDA含量较模型组降低， CBC中、高剂量组SOD活性升高。见表2。

表2 各组小鼠血清ALT、AST及肝组织MDA和SOD含量比较(n=10)

#：与正常对照组比较，P<0.05；*：与模型组比较，P<0.05。

2.5各组小鼠肝组织病理学表现正常对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐，肝窦清晰。模型组小鼠肝小叶结构不清，肝细胞索排列紊乱，较多肝细胞发生气球样变性，多数细胞内可见大小不等的脂滴空泡，多分布在中央静脉周围，汇管区出现较多炎性细胞浸润，可见点状坏死灶。CBC各给药组肝细胞肿胀程度及气球样变减轻，炎细胞浸润减少，点状坏死减少，以中、高剂量组最为明显。见表3和图1。由表3可知，CBC各剂量组小鼠肝组织病理改变均有不同程度的改善。

A：正常对照组；B：模型组；C：BP阳性对照组；D：CBC高剂量组；E：CBC中剂量组；F：CBC低剂量组。 图1 各组小鼠肝组织病理学表现(HE，×200)

3 讨论

HepG2.2.15细胞是由带有HBV-DNA全基因的重组质粒转染人肝癌细胞株HepG2获得[7]，能分泌HBsAg和HBeAg，可间接反映乙肝病毒的复制情况[8]，是目前最常用的抗乙肝病毒药物筛选模型。该研究结果显示CBC对HBsAg和HBeAg具有一定的抑制作用，且对HBeAg的抑制作用更强，推测可能为药物作用的靶点不同所致，课题组前期研究[3]表明CBC抗HBV的主要成分为倍半萜类。

近年来酒精性肝病的发病率明显上升。研究[9]认为乙醇可通过多种途径造成肝损伤，目前公认的为氧自由基参与的脂质过氧化途径，所以清除自由基和抑制脂质过氧化已成为抗酒精性肝损伤的研究热点。

正常情况下，ALT和AST主要存在于细胞液中。发生酒精性肝损伤时，肝细胞膜受损，释放出ALT、AST，血清中ALT和AST含量急剧升高，因此血清ALT、AST的活性检测是酒精性肝损伤的一个重要指标[10]。自由基本是人体生化反应中正常的中间产物，当发生酒精性肝损伤时，自由基产生过多，动态平衡被打破。正常情况下细胞内存在的SOD抗氧化酶能抑制自由基启动的脂质过氧化反应，以防御自由基对肝脏的损害。MDA是脂质过氧化的终产物，其含量的多少可间接反映肝细胞过氧化受损程度[11]。另外，肝组织病理学检查能客观反映肝脏受损程度。该研究结果显示模型组发生不同程度的肝细胞肿胀变性、炎症，甚至出现坏死情况，说明建模成功；而CBC各给药组小鼠血清ALT、AST活性不同程度地降低，SOD活性升高，MDA含量降低，并且肝细胞水肿、炎症、坏死等病理学变化有不同程度的改善。有研究[12]表明CBC肝保护作用的主要成分为黄酮类。

综上所述，CBC既有抗HBV的作用又对酒精性肝损伤有保护作用，其可能是通过提高机体抗氧化能力，加速清除自由基，抑制脂质过氧化反应来达到肝保护的作用。CBC有望在保肝药品领域得到进一步的开发和利用。

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(2017-01-05收稿 责任编辑徐春燕)

Effects of Yejuhuabaogan capsule on HBV and acute alcoholic liver injury in mice

WANGZhenji,MENGXiaoqian,LIUWenya,YANJinghua,XUJiahui，XULihua，BIYuefeng

SchoolofPharmaceuticalSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

Yejuhuabaogan capsule；HBV；alcoholic liver injury；mouse

Aim: To investigate the effects of Yejuhuabaogan capsule(CBC) on HBVinvitroand acute alcoholic liver injuryinvivo. Methods: HepG2.2.15 cells were divided into 9 groups，and were treated with 0.000,0.625,1.250,2.500,5.000,10.000,20.000,40.000, and 80.000 mg/L CBC for 72 hours. CCK-8 assay was used to detect the cell proliferation. HepG2.2.15 cells were assigned into 6 groups and were treated with 0.000,0.125,0.250,0.500,1.000 mg/L CBC and 100 mg/L lamivudine,and ELISA was used to detect the secretion of HBsAg and HBeAg by HepG2.2.15 cells on the 6th and 9th day after the treatment. Kunming mice were allocated into 6 groups: control group, model group, BP positive control group(150 mg/kg), CBC groups with high, middle and low dosages(280, 140 and 70 mg/kg). The liver injury model was prepared with the volume fraction of 53% ethanol by gavage. The levels of serum ALT and AST were determined, and liver homogenate was prepared to detect SOD and MDA activity after 10 days. The liver was studied by pathological examination. Results: CBC reduced the contents of HBsAg and HBeAg secreted by HepG2.2.15 cells on the 6th and 9th day(P<0.05).TC50andTC0of CBC were 5.014 and 0.231 mg/L,respectively. CBC reduced the serum levels of ALT and AST, and increased SOD activity, depressed MDA content(P<0.05). CBC could alleviate liver injury,especially at the high and middle doses(P<0.05).Conclusion: CBC has anti-HBV effects as well as the protective effects on the alcoholic liver injury.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.008

R575

#通信作者，女，1969年7月生，博士，教授，研究方向：天然药物化学及天然健康产品研究开发，E-mail:zzubyf@126.com

*国家自然科学基金面上项目 30973872；河南省科技攻关计划项目 162102310128