CD4+CD25+调节性T细胞治疗反复性流产的动物实验研究

段 彪 王 璐 黄薇薇 王守红 杜海燕

内蒙古医科大学第三附属医院妇产科生殖中心 (包头，014010 )

·基础研究·

CD4+CD25+调节性T细胞治疗反复性流产的动物实验研究

段 彪 王 璐 黄薇薇 王守红 杜海燕*

内蒙古医科大学第三附属医院妇产科生殖中心 (包头，014010 )

目的：通过动物实验，探讨CD4+CD25+调节性T细胞用于反复性流产免疫治疗的效果。方法：密度梯度离心法从正常昆明白新生鼠的血液和能正常生育的BALB/c雄鼠血液中分别分离单核淋巴细胞，再用免疫磁珠法筛选出CD4+CD25+调节性T细胞；以CBA/J雌鼠×DBA/2J雄鼠交配组合作为反复自然流产的动物模型，于孕期给予鼠尾静脉注射不同种类的淋巴细胞；采用独立样本t检验对各组得到的数据进行分析和处理。结果：注射CD4+CD25+T细胞组小鼠CD4+CD25+T细胞在CD4+T细胞中的占比为(17.49±0.60)%，高于注射单核淋巴细胞组的(14.68±0.83)%、无菌PBS组的(9.54±0.85)%和不注射组的(9.28±0.68)%(t=4.754，P<0.05；t=13.242，P<0.05；t=15.621，P<0.05)。CD4+CD25+调节T细胞中的Foxp3蛋白相对表达量(5.85±0.45)高于注射单核淋巴细胞组(2.86±0.54)、无菌PBS组(1.08±0.16)和不注射组(1.00±0.00)(t=7.276，P<0.05；t=17.227，P<0.05；t=18.635，P<0.05)。在第4天和第8天分别注射调节T细胞得到了较好的效果，胚胎吸收率为(4.92±0.08)%，低于注射单核淋巴细胞组的(13.07±0.06)%、注射无菌PBS组的(23.11±0.12)%和不注射组的(25.47±0.11)%(t=-2.603，P<0.05；t=-4.012，P<0.05；t=-4.700，P<0.05)。结论：给反复性流产小鼠于孕期进行多次CD4+CD25+T细胞注射，免疫治疗效果好于传统的注射单核淋巴细胞。

调节性T细胞；反复性流产；免疫治疗；免疫耐受

针对同种免疫异常所致的反复自然流产(RSA)患者，临床上采用父方或无关第三方个体外周血分离得到的淋巴细胞进行主动免疫治疗。虽然主动免疫治疗能提高封闭抗体阴性所致RSA患者的妊娠率[1]，但由于RSA发病因素复杂，传统的治疗方法存在局限性。一些证据表明，RSA患者体内调节T细胞数量和功能明显下降，使得Th1型免疫应答过强和Th2型免疫应答不足，从而导致流产的发生[2-3]。因此，通过人为补充体内调节T细胞有可能成为治疗RSA的一条新策略。CD4 +CD25+调节性T细胞是具有免疫负性调节功能的一类CD4+T辅助细胞，其表面特征性地表达IL-2 受体分子( CD25)[4]。目前，从成人的外周血中获得调节性T细胞的比例较低(1%～2%)，阻碍了调节性T细胞用于免疫治疗[5]。相反，从脐血中可以获得较大比例的CD4+CD25+调节性T细胞亚群，而且所得细胞处于相对原始状态，不容易被体外刺激变成效应T细胞[6]，为临床的应用研究提供了极大的方便。本研究通过动物实验，探讨CD4+CD25+调节性T细胞用于RSA患者的免疫治疗，为治疗RSA提供新的治疗思路。

1 材料和方法

1.1材料

Ficoll-Hypaque为Amersham Bioscience公司生产；免疫磁珠分离试剂盒购自MiltenyiBiotec公司；RPMI1640培养液购自为Invitrogen-Gibco公司；磷酸缓冲液(PBS)购自Hyclone公司；8%多聚甲醛购自Electron Microscopy Sciences公司；Triton X-100和台盼蓝为Sigma公司生产；Tween 20和牛血清白蛋白BSA为Amresco公司生产；各种抗体为Abcam/jacksonimmunoResearch公司生产；昆明白雌鼠(6周龄、SPF级、22.7±2.2g)和雄鼠(8周龄、SPF级、28.9±2.6g)购自内蒙古大学实验动物中心；雌性CBA/J小鼠(6周龄、SPF级、19.3±1.8g)、雄性DBA/2J(8周龄、SPF级、24.3±2.4g)和雄性BALB/c小鼠(8周龄、SPF级、25.4±1.5g)均购自南京大学模式动物研究所。

1.2脐血来源的CD4+CD25+阳性调节T细胞的分离和筛选

抽取昆明白鼠血液10ml，置于15ml的抗凝无菌离心管中，用Ficoll-Hypaque密度梯度法[6]分离血液中的单核细胞。用无菌的PBS 1：1稀释脐血，置于10ml Ficoll-Hypaque液上方；400×g, 25min离心，回收白色细胞层。CD4+T细胞用免疫磁珠分离试剂盒(含有CD8、CD11b、CD16、CD19、CD36和CD56的混合抗体)进行富集并过柱处理。总阳性细胞再通过抗CD25+的磁珠阳性分选，加入10μl 抗鼠CD25-PE/106单核细胞，30min冰孵, 300×g, 10min离心；250μl MACS缓冲液中重悬细胞，加入10μl 抗-PE MACS磁珠，30min冰孵，300×g, 10min离心；500μl MACS缓冲液中重悬细胞，过柱；回收阳性细胞。

1.3 BALB/c雄鼠外周血单核淋巴细胞的分离

为了模拟人类反复性流产的免疫治疗，选择能正常生育的BALB/c雄鼠作为无关第三方血液来源，用Ficoll-Hypaque密度梯度法分离血液中的单核淋巴细胞。

1.4反复性流产小鼠模型的建立

根据CBA/J雌鼠×DBA/2J雄鼠交配组合常作为反复自然流产的动物模型,流产率为20%～40%，相对恒定[7]。交配及妊娠确定：流产组为CBA/J雌鼠×DBA/2J雄鼠，对照组为CBA/J雌鼠×BALB/c雄鼠。两组小鼠按雄:雌=1:2的比例于拟交配日17:30称重后合笼，次日早、晚8:00各检查阴道栓1次，见栓后分笼饲养(见栓日记为孕0.5d)。

1.5脐血调节T细胞注射RSA小鼠模型

将RSA孕鼠随机分为7组，第1、2、3和7组的数量为15只，第4、5、6组数量为10只。第1、2、3组的孕鼠于孕第4天分别给予尾静脉注射调节T细胞[细胞浓度(2～2.5)×106/ml，注射量50μl]、BALB/c雄鼠外周血来源单核淋巴细胞[细胞浓度(2～2.5)×106/ml，注射量50μl]和无菌PBS(空白对照)；第4、5和6组的孕鼠于孕第4天和第8天分别给予尾静脉注射调节T细胞[细胞浓度(2～2.5)×106/ml，注射量50μl]、BALB/c雄鼠外周血来源单核淋巴细胞[细胞浓度(2～2.5)×106/ml，注射量50μl]和无菌PBS；第7组不注射。

1.6 CD4+CD25+T细胞的检测

流式细胞术检测脾脏CD4+CD25+T细胞。将上述1、2、3和7组的5只孕鼠处理后得到的脾脏单核细胞离心沉淀，加入无菌的PBS充分洗涤。计算细胞总数，每只小鼠(5～6)×107个细胞。细胞中分别加入10μg/ml FITC标记的抗CD4和5μg/ml PE标记的抗CD25单克隆抗体，充分混匀细胞后进行流式细胞分选。

1.7 CD4+CD25+T细胞中Foxp3表达的检测

1.8胚胎发育情况的观察

在妊娠第13天分别将各组的10只CBA/J孕鼠处死，计算各组吸收胚胎个数及存活胚胎个数，根据公式计算胚胎吸收率(被吸收胚胎数/总胚胎数×100%)。

1.9统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,采用独立样本t检验比较两组小鼠的CD4+CD25+T细胞比例、FoxP3表达率的变化和不同注射方法的胚胎吸收率。检验度a=0.05(双侧)。

2 结果

2.1 CD4+CD25+T细胞的占比

1组与2组、3组、7组比较，差异均有统计学意义(t=4.754，P<0.05；t=13.242，P<0.05；t=15.621，P<0.05)。2组分别与3组、7组比较，差异均有统计学意义(t=7.529，P<0.05；t=8.737，P<0.05)。3组与7组比较，差异无统计学意义(t=0.415、P>0.05)。见表1。

表1 各组CD4+T、CD4+CD25+T细胞检测结果

*与1组比较#与2组比较P<0.05

2.2 CD4+CD25+T细胞中Foxp3的表达

使用Image J软件对Western Blot结果(图2)进行灰度分析，得出的灰度值与7组的灰度值进行倍性比较得出蛋白相对表达量。结果显示，1组Foxp3的相对蛋白表达量(5.85±0.45)与2组(2.86±0.54)、3组(1.08±0.16)、7组(1.00±0.00)比较，差异均具有统计学意义(t=7.276,P<0.05；t=17.227,P<0.05；t=18.635，P<0.05)；2组与3组、7组比较，差异均具有统计学意义(t=5.385，P<0.05；t=5.871，P<0.05)；3组与7组比较，差异无统计学意义(t=-0.846，P>0.05)。见图1。

2.3胚胎发育情况的观察

4组的胚胎吸收率与5组、6组、7组比较，差异均有统计学意义(t=-2.603，P<0.05；t=-4.012，P<0.05；t=-4.700，P<0.05)。1组与2组、3组比较，差异无统计学意义；与7组比较，差异有统计学意义(t=-2.177，P<0.05)。见表2。

A：Foxp3的表达 B：-Actin作为内参基因的表达

表2 各组胚胎吸收情况比较

*与7组比较P<0.05#与4组比较P<0.05

3 讨论

在RSA发病中占据较大比例的是同种免疫型RSA，是在同一种属之间针对不同的抗原成分发生的免疫反应，约50%找不到明确病因的RSA患者属于这个类别。妊娠相当于同种异体移植[8]，胎儿所携带的父系HLA抗原可刺激母体免疫活性细胞产生免疫应答；同时母体内又存在有免疫抑制功能的细胞，在胚胎所携带的父系抗原刺激下，这种细胞也增加，从而维持免疫耐受状态。免疫应答和免疫抑制相平衡，才使胎儿成活直至分娩。CD4+CD25+调节性 T 细胞具有免疫负性调节功能和低反应性的特点，通过细胞间接触抑制及分泌抑制性细胞因子等途径发挥抗炎和维持自身免疫耐受。Forkhead box p3(Foxp3)是调节T细胞内的标记分子，是特异性调节因子，对调节T细胞在胸腺内的发育、在外周血的分布以及免疫抑制功能的维持具有重要作用。研究证实，新近发现的 IL-35 这种少见的免疫抑制分子正是由Foxp3+的调节T细胞分泌，通过调节效应T细胞的活性达到免疫抑制的目的[9]。

本实验比较了注射CD4+CD25+T细胞和传统通过单核淋巴细胞用于反复性流产的免疫治疗。流式细胞术检测结果显示，CD4+CD25+T细胞注射组(1组)的CD4+CD25+T细胞在CD4+T细胞的占比均高于单核淋巴细胞注射组(2组)、注射PBS组(3组)和不注射组(7组)，说明注射CD4+CD25+T细胞比注射单核淋巴细胞会导致机体产生比例更多的调节T细胞。与空白对照组和不注射组相比，传统的注射单核淋巴细胞也会导致调节T细胞占比的提高，这可能解释了传统方法有效的原因[10]。Western Blot检测结果显示，CD4+CD25+T细胞注射组CD4+CD25+T细胞表达的Foxp3蛋白量更多，而Foxp3是调节T细胞的特异性调节因子，注射CD4+CD25+T细胞似乎会导致机体表达更多的Foxp3蛋白，从而更有利于发挥免疫抑制功能[11]。本实验结果显示，第4天和第8天两次注射CD4+CD25+T细胞组(4组)的胚胎吸收率均低于两次注射单核淋巴细胞组(5组)、两次注射PBS组(6组)和不注射组(7组)，说明妊娠后两次注射调节T细胞组比传统的注射单核淋巴细胞更适合RSA的治疗[12]。妊娠单次注射CD4+CD25+细胞组与第4天注射单核淋巴细胞组和注射PBS相比没有差别，说明单次注射CD4+CD25+调节T细胞没有获得治疗上的优势。

结论：动物实验结果提示， 通过人为补充体内CD4+CD25+T调节T细胞有可能成为治疗RSA的一条新策略。

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[责任编辑：张 璐]

AnimalstudyonCD4+CD25+regulatoryTcellsfortreatingfemalemousewithrecurrentspontaneousabortion

Duan Biao, Wang Lu, Huang Wewei, Wang Shouhong, Du Haiyan*

ReproductiveCenterofDepartmentofObstetricsandGynecology,ThirdAffiliatedHospital,InnerMongoliaMedicalUniversity,BaoTou,InnerMongolia, 014010

*Correspondingauthor: 13947268268@139.com

Objective: To explore immunotherapy effectiveness of the CD4+CD25+regulatory T cells for treating female mouse with recurrent spontaneous abortion (RSA) by animal experiments. Methods: Mononuclear lymphocytes were isolated from the blood (instead of cord blood) of new-born baby of KunMing Bai mouse or BALB / c male mouse with normal birth ability (as unrelated third party blood source) by density gradient centrifugation method. The CD4+CD25+regulatory T cells were selected by magnetic-activated cell sorting from mononuclear cells of cord blood cells. CBA/J female mouse copulated with DBA/2J male mouse was utilized as RSA animal model. Pregnant RSA mice were injected different types of lymphocytes through tail vein. Independent sample t-test was used to analyze the data from each group. Results: The proportion of CD4+CD25+T cells in CD4+T cells of injected CD4+CD25+regulatory T cells group was (17.49 ± 0.60) %, which was statistical significant higher than that of mononuclear lymphocyte injection group (14.68±0.83) %, sterile PBS group (9.54±0.85) % or no injection group (9.28±0.68)%, (P< 0.05, t values was 4.754, 13.24 and 15.62, respectively). The Foxp3 relative protein expression level of CD4+CD25+regulatory T cells injected group was 5.85±0.45, which was also significant higher than that of mononuclear lymphocyte injection (2.86±0.54), sterile PBS group (1.08±0.16) or no injection group (1.00±0.00) (P< 0.05, t values were 7.27、17.23 and 18.64, respectively). Finally, two times of CD4+CD25+T cell injected group at the 4th and 8th day had well effect for RSA mouse, and embryo sorption rate was 4.92±0.08%, which significant lower than that of two times of mononuclear lymphocyte injected group (13.07±0.06)%, sterile PBS group (23.11±0.12)%, or no injection group (25.47±0.11)%, (P< 0.05, t values was -2.60, -4.01 and -4.01, respectively,). Conclusion: Pregnant mouse with RSA injected CD4+CD25+T cells several times for immunotherapy can get better effectiveness than that of pregnant mouse injected traditional mononuclear cells.

Regulatory T cells; Recurrent spontaneous abortion; Immune therapy; Immune tolerance

10.3969/j.issn.1004-8189.2017.06.002

2016-12-16

2017-04-12

*通讯作者：13947268268@139.com