100例多发性骨髓瘤患者荧光原位杂交结果汇总分析

胡斌 刘林湘 陈丹丹

100例多发性骨髓瘤患者荧光原位杂交结果汇总分析

胡斌 刘林湘 陈丹丹

(郑州大学第一附属医院 血液科 河南 郑州 450000)

目的探讨荧光原位杂交(FISH)技术检测在多发性骨髓(MM)诊断和治疗中的作用及临床意义。方法应用FISH技术，采用特异性探针(RB1、P53、D13S319、IGH及Iq21)，对100例初诊MM患者进行检测，分析其染色体异常情况，与患者的临床指标进行相关性分析。结果FISH技术检测100例初诊MM患者中60例(60%)基因异常，其中IGH重排42例(42%)，Iq21扩增32例(32%)，RB1缺失23例(23%)，D13S319缺失21例(21%)，P53缺失5例(5%)。各基因异常结果与临床指标相关性分析如下：IGH基因重排与骨髓内浆细胞水平(>30%)、ISS分期存在相关性；del(13q)与ISS分期、骨髓浆细胞水平(>30%)及β2-微球蛋白水平(β2-MG)水平存在相关性；Iq21扩增与β2-MG、ISS分期存在相关性；P53缺失检出率最低，预后可能较差。MM患者存在染色体异常的主要以IgG型和Ⅲ期为主。结论MM最常见的基因异常是IGH基因重排以及Iq21扩增，其次是RB1和D13S319缺失，P53缺失最少。Ⅲ期和IgG型患者出现染色体异常的可能性更高。FISH的检出率要优于染色体常规核型分析(CC)技术，FISH联合CC可作为MM患者的常规检查，指导临床治疗。

多发性骨髓瘤；染色体；荧光原位杂交；基因异常

多发性骨髓(multiple myeloma，MM)是一种中老年常见的骨髓浆细胞克隆增生性恶性肿瘤，其生存期变化很大，短者不足1 a，长者可存活10 a以上，这些显著差异表明影响MM的预后因素较为复杂。近年来研究证实，细胞及分子遗传学异常是影响MM预后的重要因素。多发性骨髓瘤染色体异常改变较多，其中以1号染色体(Iq21扩增)、13号染色体(D13S319和RB1基因缺失)、14号染色体(IGH基因异位)及17号染色体(P53基因缺失)的异常较为常见。本研究通过荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)对郑州大学第一附属医院初诊的100例MM患者进行检测，分析其染色体异常情况，与相关临床指标进行相关性分析，探讨FISH检测在多发性骨髓诊断和治疗中的作用及临床意义。

1 资料与方法

1.1对象选取郑州大学第一附属医院2015年3月至2016年11月期间收治的100例初诊多发性骨髓瘤患者，所有患者均行骨髓穿刺、免疫固定电泳、X线、CT等检查，同时行原位荧光杂交技术检测，其诊断均符合张之南等主编的《血液病诊断及疗效标准》[1]，其中男65例，女35例；年龄为39～80岁，中位年龄57岁。IgG型46例，IgA型27例，IgD型2例，IgM型2例，轻链型20例，未分泌型3例。

1.2主要试剂GLPRB1 DNA探针、GLPP53 DNA 探针、GLPD13S319 DNA 探针、GLPIGHDNA 探针、GLPIq21 DNA 探针，以上探针均购自北京金菩嘉公司。

1.3FISH方法肝素管采集患者骨髓液2 ml，提取有核细胞、制片，按照探针试剂说明书进行DNA变性、杂交、洗片、制片、复染。在荧光显微镜下选用合适的滤片观察结果。判断标准：GLPRB1 DNA和GLPP53 DNA探针正常间期细胞表现为2个绿色荧光信号，异常细胞为1个绿色信号；GLPIq21 DNA探针正常间期细胞表现为2个红色信号，异常细胞为3个红色信号；GLPD13S319探针正常细胞表现为2个红色信号，异常细胞为1个红色信号；GLPIGHDNA 探针正常间期细胞表现为2个黄色信号，异常细胞为1个橘红色信号、1个绿色信号和1个黄色信号或者2个橘红色、2个绿色信号。当异常细胞数>±3 s为阳性[2]，由此计算出RB1、D13S319、P53、Iq21、IGH的阳性率分别为>9.005%、9.430%、8.572%、8.572%、8.087%、9.194%。

1.4统计学分析采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1FISH检测结果100例MM患者中，检出60例基因异常，异常检出率为60%。累及1种基因异常31例，累计2种10例，3种9例，4种9例，5种1例。其中IGH重排42例(42%)，Iq21扩增32例(32%)，RB1缺失23例(23%)，D13S319缺失21例(21%)，P53缺失5例(5%)。

2.2FISH结果与患者的一般临床资料相关性MM患者存在染色体异常的主要免疫分型为IgG型，D-S分期为ⅢA型。染色体异常与年龄、性别、血小板、血红蛋白、血钙、LDH、CRP、血肌酐、白蛋白、免疫学分型、D-S分期无相关性，差异均无统计学意义(P>0.05)，而染色体异常与β2-MG、浆细胞数、ISS分期存在相关性。见表1～3。

表1 染色体异常与β2-MG的关系

表2 染色体异常与浆细胞数的关系

表3 染色体异常与ISS分期的关系

3 讨论

随着FISH技术的出现，对MM遗传学异常的研究逐渐深入，有研究发现几乎所有的MM患者都有不同程度的遗传学异常[3]。尽管染色体常规核型分析(CC)技术仍是临床上检测染色体的常规手段，但国内文献报道的MM通过常规染色体核型分析检出率仅为32.1%[4]。本研究分析了100例FISH检测结果，发现1种以上异常60例，检出率为60%。这表明FISH的检出率要优于CC技术，这是由于常规染色体检查受细胞增殖影响比较大，MM异常浆细胞增殖活性较低，检出率低。FISH不受浆细胞的分选限制，检出率较高。但是FISH技术只能对特定的位点进行检测，无法检测未知的染色体易位、缺失或扩增等，而CC技术可弥补其不足[5]。因此，临床上可用常规染色体核型分析技术和FISH技术相配合，提高对染色体异常的检测水平。国外文献报道应用FISH技术检出率为69.4%[6]，本研究低于国外文献报道，考虑可能与本研究条件有限所致。目前国外和国内部分中心采用CD138磁珠分选联合FISH技术检测提高了异常检出率，这督促本研究FISH技术水平需要继续改进和提高。

在本研究中，IGH基因(14q32)重排是MM染色体异常中发生最频繁的事件，这与国外的报道[6]一致。14q32与多条伙伴染色体发生易位而导致IGH基因重排，可引起相关染色体区域的原癌基因被激活，这可能是导致MM发病的分子遗传学机制之一[7]。本研究发现IGH基因重排与骨髓内浆细胞水平(>30%)、ISS分期有显著相关性，这与国内赵丽等[8]研究发现不太相符。在42例IGH基因重排阳性的患者中，其中71%的患者达到疾病Ⅲ期，提示发生IGH基因重排时，大部分患者已处于疾病晚期。IGH基因重排检测的重要性已在研究中得到证实，国外已开始将应用FISH技术检测IGH重排及其常见亚型的鉴定列入初诊患者的必查项目中。

RB1和D13S319位点是13q的主要缺失部位，在本研究中，2个位点的检出率分别为23%和21%，低于文献报道的38.6%和36.4%[9]，其中同时具有2个位点异常的有19例。Schmidt wolf等[10]的研究表明，13号染色体长臂的缺失与高骨髓瘤细胞(>30%)、贫血、血小板减少、高血肌酐及进展期病程密切相关。本研究发现del(13q)与骨髓浆细胞水平及β2-MG水平有显著相关性，但与其他临床指标未见相关性。其中β2-MG水平高低是MM不良的预后因素，13号染色体缺失是否能作为影响MM预后的一个独立因素，需长期跟踪随访患者疾病进展情况以及治疗情况来判定。

本研究发现Iq21扩增与β2-MG水平有显著相关性，32例Iq21阳性患者中，伴有β2-MG水平增高的有30例。此外Iq21多伴随其他染色体异常，其中同时伴有3种以上基因异常有15例。同时伴有多种染色体异常的预后意义，以及每种染色体异常是否有独立的预后意义，仍需后期继续跟踪随访求证。

有研究报道抑癌基因P53可调控细胞分化与凋亡，调节细胞增殖，抑制肿瘤转移及肿瘤血管再生，其突变或缺失使肿瘤容易转移，并使化疗药物不敏感，这也正是P53基因缺失或突变的患者预后差的原因之一[11]。本研究中P53的检出率最低，仅为5%，5例患者均处在疾病Ⅲ期。虽然该异常发生率并不高，但有研究显示P53基因缺失是MM患者生存期较短的一个独立的预后指标[12]。

由于本研究条件有限，无法准确对染色体异常的MM进行预后评估，今后需长期跟踪随访这些细胞遗传学异常的患者，观察患者疾病进展情况以及治疗情况，归纳不良预后类型，有助于对MM患者制定个体化治疗，从而使其在分子水平上达到缓解，获得长期生存。

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Ageneralanalysisontheresultof100patientswithmultiplemyelomabyfluorescenceinsituhybridization

Hu Bin, Liu Linxiang, Chen Dandan

(DepartmentofHematology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000,China)

ObjectiveTo investigate the effects and clinical meaning of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the diagnosis and treatment of multiple myeloma (MM) patients.MethodsBy FISH, five specific probes includingRB1,P53,D13S319,IGHandIq21 were used to study the chromosomal abnormalities of 100 newly diagnosed patients with MM in the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, the correlation between the results and the patients’ clinical indicators was analyzed.ResultsAmong the 100 cases of newly diagnosed patients with MM, there were 60 cases of chromosomal abnormalities emerged(60/100). The frequencies of abnormalities inIGHrearrangement,Iq21 amplification, the deletion ofRB1, the deletion ofD13S319 and that ofP53 were 42% (42/100), 32% (32/100), 23% (23/100), 21% (21/100) and 5% (5/100) respectively. Analysis showed that there was a correlation betweenIGHgene rearrangement and the percentage of plasma cell (>30%) as well as ISS periodization; one between del(13q) and ISS periodization, the percentage of plasma cell (>30%) and that of β2microglobulin (β2-MG); another betweenIq21 amplification and β2-MG as well as ISS periodization. In addition, the detectable rate of the deletion ofP53 was the lowest and the relevant prognosis may be worse. In a word, the chromosomal abnormalities in patients with MM mainly lie inIGHand stage Ⅲ.ConclusionThe most common chromosomal abnormalities in patients with MM areIGHgene rearrangement andIq21 amplification；the second most common ones are the deletion ofRB1 andD13S319; the least one is the deletion ofP53. It is more possible for chromosomal abnormalities to emerge in patients in stage Ⅲ andIGHones. In view of the detection rate, FISH is a better technique than karyotype analysis of Conventional Cytogenetics (CC). Thus, FISH can be used with CC as a karyotype analysis method in the clinical treatment of patients with MM.

multiple myeloma；chromosome；fluorescence in situ hybridization；chromosomal abnormalities

R 733.3doi: 10.3969/j.issn.1004-437X.2017.17.002

2016-12-21)

刘林湘，E-mail: liulinxiang6629@126.com。