窄谱抗菌肽的筛选及其溶血性分析

杭柏林,徐军,李杰,赵雪芹,魏晓晓,张慧辉,胡建和

（1.河南科技学院动物科技学院,河南新乡453003；2.新乡市畜产品质量监测检验中心,河南新乡453003）

窄谱抗菌肽的筛选及其溶血性分析

杭柏林1,徐军1,李杰2,赵雪芹1,魏晓晓1,张慧辉1,胡建和1

（1.河南科技学院动物科技学院,河南新乡453003；2.新乡市畜产品质量监测检验中心,河南新乡453003）

通过抗菌活性试验筛选了具有窄谱特性的抗菌肽,并分析了其溶血性.结果表明：抗菌肽C仅对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抗菌活性,而对其他6种革兰阴性菌、2种革兰阳性菌和3种真菌没有抗菌活性,对兔红细胞有较低的溶血性.结果为临床用药提供了帮助.

窄谱抗菌肽；筛选；溶血性；抗菌活性

Abstract:To screen the antimicrobial peptide with narrow spectrum,the antimicrobial peptides were screened with narrow spectrum characteristics through the antibacterial activity test,and its hemolytisis was analyzed.The results showed that the antibacterial peptide C had antibacterial activity only on Escherichia coli and Staphylococcus aureus, but had no antibacterial activity on the other six kinds of Gram-negative bacteria,two kinds of Gram-positive bacteria and three kinds of fungi,and had lower hemolytic on rabbit red blood cells.The result provides help for clinical medication.

Key words:narrow spectrum antibacterial peptide；screening；hemolysis；antibacterial activity

传统抗生素的大量使用或滥用导致耐药菌株不断产生[1],以及使用后产生的残留和环境污染问题威胁着人类健康[2].因此,寻求副作用低的抗生素或抗生素替代物成为必然选择.抗菌肽（antimicrobial peptide,AMP）是生命机体内的重要免疫分子,具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、免疫调节和中和体内毒素等生物学活性[3].由于抗菌肽的细胞选择性和不易产生耐药性等特点,人们认为抗菌肽是抗生素的理想替代品[4-5].目前,抗菌肽数据库APD3已收录了2 842种抗菌肽[6].不同的抗菌肽有着不同的抗菌谱,这一点与抗生素相似.广谱抗生素能破坏肠道微生物组,而窄谱抗生素如Debio1452对肠道微生物组仅有微小影响[7].广谱抗菌肽同样不能区分体内的正常菌群,这可能会限制抗菌肽的应用,而窄谱抗菌肽仅针对较少的病菌具有抗菌活性.因此,窄谱抗菌肽对由特殊病原所致疾病的治疗具有重要意义.本研究利用实验室保存的抗菌肽,并根据已知抗菌肽设计了几种新抗菌多肽,通过抑菌试验分析了这些多肽的抗菌活性,对筛选的窄谱抗菌肽进行溶血性分析,为临床治疗药物的筛选提供帮助.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 抗菌肽抗菌肽P3、JH-0、JH-1、JH-2和JH-3的氨基酸序列来自文献[8],JH-4和JH-5是根据JH-3的序列修改的多肽,A和B是从鸡内源性抗菌肽NK-lysin序列中挑选的一段序列,C是根据牛源抗菌肽indolicidin序列修改的多肽,D是根据猪内源性抗菌肽protegrin-5序列修改的多肽.抗菌肽P3、JH-0、JH-1、JH-2和JH-3以及多肽A、B、C和D由上海吉尔生化有限公司合成,多肽JH-4和JH-5由无锡亚肽生物科技有限公司合成,多肽纯度≥95%.

1.1.2 试验菌株鸡致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、鼠伤寒沙门菌、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌为实验室分离自临床病例,青霉和曲霉分离自空气,产气肠杆菌和普通变形杆菌、炭疽杆菌（疫苗株）由实验室保存.

1.1.3 试剂及仪器TSB（Tryptic Soy Broth）培养基、氨苄青霉素和制霉菌素均为Solarbio公司产品,小牛血清为上海哈灵公司产品,胰蛋白胨和酵母提取物为Oxoid公司产品,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）为邦泰生物工程公司产品.其他实验室常规试剂均为国产分析纯.打孔器（Φ为3 mm）为北京普波斯生物有限公司产品,高压蒸汽灭菌器为上海申安公司产品,生物安全柜为苏州金净公司产品,恒温培养箱为上海一恒公司产品,高速离心机和酶标仪为Thermo公司产品.

1.1.4 动物红细胞从兔耳缘静脉无菌采集血液,用肝素抗凝,4℃保存,备用.

1.2 试验方法

1.2.1 抗菌活性检测用琼脂糖平板扩散法[9]测定抗菌肽对受试细菌的抗菌活性.将培养的受检菌株混于1 mL底层培养基（TSB 0.1 g,超纯琼脂糖0.1 g,加超纯水至10 mL,pH 7.4）中,凝固后打孔（直径约3 mm）,封底；每孔中加5 μL抗菌肽样品,阳性对照用氨苄青霉素（针对革兰阴性菌和革兰阳性菌）,阴性对照用PBS；37℃倒置1 h；添加10 mL上层覆盖培养基（TSB 0.6 g,超纯琼脂糖0.1 g,加超纯水至10 mL,pH 7.4,50℃左右）；37℃倒置过夜培养；根据有无抑菌圈来判定所测抗菌肽有无抗菌活性.

按照文献[10]的方法测定抗菌肽的抗真菌活性.取10 μL抗菌肽样品加入96孔板的小孔中,再加入用SDA液体培养基调好浓度的真菌孢子悬液100 μL,同时设PBS为阴性对照,设置霉菌素为阳性对照, 28℃培养48 h（白色念珠菌）或72 h（青霉和曲霉）,用肉眼观察法观察培养液浑浊度,根据浑浊度判断所测抗菌肽有无抗真菌活性.

1.2.2 溶血性测定按照文献[11]的方法进行抗菌肽的溶血性测定.抗凝血经1 300 r/min离心5 min,用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤沉淀3次,再用PBS配制1%红细胞.用PBS将抗菌肽质量浓度调整为16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/mL,加入等体积的红细胞悬液.以PBS为阴性对照,以1%Tritonx-100为阳性对照,37℃作用1 h,1 300 r/min离心5 min,将上清液依次加入96孔板,用酶标仪测540 nm处的OD值.溶血率/%=（检测孔OD值-阴性孔OD值）/（阳性孔OD值-阴性孔OD值）×100.

2 结果与分析

2.1 抗菌肽的抗菌活性

抗菌肽对7种革兰阴性菌、3种革兰阳性菌和3种真菌的抗菌活性结果如表1所示.

由表1可知,抗菌肽P3、JH-0、JH-1、JH-2仅对1种革兰阴性菌没有抗菌活性,抗菌肽JH-4、JH-5和A对2种革兰阴性菌没有抗菌活性,抗菌肽B对3种革兰阴性菌没有抗菌活性,抗菌肽C对6种革兰阴性菌没有抗菌活性,而抗菌肽D对7种所试革兰阴性菌均没有抗菌活性；抗菌肽P3、JH-2、JH-3仅对1种革兰阳性菌没有抗菌活性,抗菌肽JH-0、JH-1、JH-4、JH-5、C对2种革兰阳性菌没有抗菌活性,而抗菌肽A、B、D菌株对3种革兰阳性菌均无抗菌活性；抗菌肽P3、JH-3仅对1种真菌没有抗菌活性,抗菌肽JH-2、JH-4、JH-5对2种真菌没有抗菌活性,而抗菌肽JH-0、JH-1、A、B、C、D对3种真菌均无抗菌活性.综合分析,抗菌肽C为窄谱抗菌肽.

表1 抗菌肽对细菌和真菌的抗菌活性Tab.1 Antibacterial activityofantimicrobial peptides against bacteria and fungi

2.2 溶血性分析

对抗菌肽C进行溶血性分析,结果如图1所示.

图1 抗菌肽C对兔红细胞的溶血性分析Fig.1 Hemolysis analysis ofantimicrobial peptide Ctorabbit erythrocyte

从图1可以看出：在8 μg/mL的质量浓度下,溶血率约为8%；在20 μg/mL的质量浓度下,溶血率约为13%；40 μg/mL的质量浓度下,溶血率约为16%.由此可见,随着浓度的升高,溶血率也随之升高,但在质量浓度超过20 μg/mL时,溶血率升高缓慢.

3 结论与讨论

抗菌肽因其独特的氨基酸组成、电荷、空间构像与结构、两亲性、疏水性等特征而有着独特的作用机制[12].一般认为,抗菌肽的作用机制主要为膜作用机制和胞内作用机制,但还没有一个涵盖所有抗菌肽作用机制的理论[13].不同的抗菌肽可作用于不同的靶标而发挥作用.广谱抗菌肽可作用于通用靶标而发挥抗菌作用,窄谱抗菌肽可作用于特异的靶标而发挥抗菌作用.Qiu等[14]获得一个窄谱的嵌合抗菌多肽,其对粪肠球菌万古霉素抵抗株具有较好的杀灭作用,能使粪肠球菌万古霉素抵抗株感染小鼠存活.地衣芽胞杆菌M-4株分泌的抗菌肽fungicin M4仅对犬小孢子菌、毛霉、申克孢子丝菌、巨大芽胞杆菌、谷氨酸棒状杆菌有抑菌活性[15].解没食子酸链球菌马其顿亚种ST91KM产生的细菌素ST91KM是一种对奶牛乳房炎相关细菌有抑菌活性的窄谱多肽[16].

临床上应用抗菌肽治疗疾病时,可采用类似于抗生素的“降阶梯治疗（de-escalation therapy）”策略[17],即感染初始使用广谱抗菌肽,在细菌培养和药敏结果获得之后,使用针对性的窄谱抗生素.本研究获得窄谱抗菌肽C仅对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑菌活性,但其对肠道微生物组的影响还不甚清楚,值得深入探讨.

虽然抗菌肽的溶血机制还不是很清楚,但是抗菌肽的溶血性会限制抗菌肽的开发与应用.因此,低溶血性或无溶血性的抗菌肽具有较好的应用前景.抗菌肽的阳离子性和双亲性结构是抗菌肽溶血性的基础.低溶血性或无溶血性的抗菌肽的抗菌机制除了阳离子性和双亲性外可能还有其他的机制.因此,本研究筛选到的低溶血性窄谱抗菌肽C可能还有其他的抗菌机制.

本研究通过抑菌试验分析11种抗菌肽对受试的革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌的抗菌活性,筛选到抗菌肽C为窄谱抗菌肽,其仅对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抗菌活性,对兔红细胞有较低的溶血性.

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（责任编辑：卢奇）

Screening of antimicrobial peptide with narrow spectrum and analysis of hemolysis

HANG Bolin1,XU Jun1,LI Jie2,ZHAO Xueqin1,WEI Xiaoxiao1,ZHANG Huihui1,HU Jianhe1
（1.College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine,Henan Institute ofScience and Technology, Xinxiang453003,China；2.XinxiangCenter ofMonitor and Inspection for QualityofLivestock Production,Xinxiang453003,China）

S859

A

1008-7516（2017）04-0037-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2017.04.007

2017-05-17

国家自然科学基金（31672559）；河南省高校科技创新团队支持计划（15IRTSTHN）；河南科技学院高层次人才启动项目（2014020）；河南科技学院“百农英才”创新项目（BNYC2015-2-07,BNYC2015-2-09）

杭柏林（1978—）,男,江苏海安人,博士,讲师.主要从事动物病原与新兽药研究.

胡建和（1968—）,男,河南辉县人,博士,教授.主要从事动物病原与新兽药的研究.