青岛市流行性出血热的汉坦病毒检测和其基因型的研究

朱元祺，贾 楠，田清武，吴国才，董丹丹，张 会，李延年*

(1.青岛大学附属医院 检验科，山东 青岛266003；2.青岛大学医学院)

青岛市流行性出血热的汉坦病毒检测和其基因型的研究

朱元祺1，贾 楠2，田清武1，吴国才1，董丹丹2，张 会2，李延年1*

(1.青岛大学附属医院 检验科，山东 青岛266003；2.青岛大学医学院)

目的探讨引起青岛市流行性出血热的汉坦病毒(Hantavirus,HV)的感染类型，以明确基因亚型和进化特点。方法免疫胶体金法检测126份临床怀疑急性期病人血清中汉坦病毒的抗体。RT-PCR 扩增病毒的S 基因段，并经测序获得基因序列。病毒的核苷酸序列分析和构建系统进化树应用DNASta软件，并以确定病毒的型别。结果126份血清标本中，112份汉坦病毒IgM和(或)IgG抗体阳性。经RT-PCR 扩增获得7株汉坦病毒S基因序列，与汉滩型(Hantaan virus,HTN)和汉城型(Seoul virus,SEO)毒株比较，其中2株为HTN型，5株为SEO型，相互间序列达到68%-98.9%同源性。结论引起青岛市流行性出血热的汉坦病毒为汉滩型和汉城型的混合感染，以汉城型为主。

汉坦病毒；S 基因；感染；汉滩型；汉城型

(ChinJLabDiagn,2017,21:1314)

汉坦病毒(Hantavirus，HV) 基因组由大(L)、中(M)、小(S)三个节段组成，可引起人类流行性出血，即肾综合征出血热( HFRS)。尽管汉坦病毒新型或新亚型不断被发现，但引起人肾综合征出血热的病毒亚型主要是汉滩型(Hantaan virus，HTN)和汉城型(Seoul virus ，SEO)[1]。因此，我们对临床高度怀疑为肾综合征出血热的病人进行抗体检测，同时设计引物扩增S基因序列，并与汉滩型(M14626)和汉城型(M34881)标准毒株的序列进行比较，了解引起青岛市流行性出血热的汉坦病毒的感染类型，以明确基因亚型和进化特点，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 汉坦病毒抗体的检测

收集126份临床怀疑肾综合征出血热病人的血清，采用胶体金法检测汉坦病毒的IgM和IgG抗体。试剂由厦门市波生生物技术有限公司提供，具体操作和结果的判断按说明书。

1.2 主要仪器和试剂

RT-PCR扩增试剂盒、核酸分子量标准和琼脂糖为大连宝生物；美国Bio-RAD公司MyCycle型PCR扩增仪；美国Alpha Innotech公司HP3400型全自动凝胶成像系统。

1.3 病毒核糖核酸的提取

从肾综合征出血热病人的血清中提取病毒核糖核酸，是按照上海之江生物科技股份有限公司提供的试剂盒说明书进行。保存于-80℃备用。

1.4 引物设计和RT-PCR扩增

参照相关文献[1]，根据汉坦病毒标准株(76-118)的序列，设计两对扩增S基因的引物。QSF1:5′-TAGTAGTAGACTCCCTAAAGA-3′，QSR1：5′-CCCGAGTGGTACAAGGAACGG-3′。

QSF2:5′-GCACTGGCAAAAGATTGGACA-3′,QSR2：5′-AAATCCCTCAGATGATGAT-3′。扩增条件:62℃ 1 min，45℃ 10 min，53℃ 30 min，95℃15 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min 40 个循环。北京睿博兴科生物技术有限公司完成引物合成和产物测序。

1.5 核苷酸同源性和系统发生树分析

扩增产物经睿博兴科生物公司双向测序、拼接，应用DNASta软件与数据库中已知汉滩型(M14626)和汉城型(M34881)标准株序列进行比对，以分析临床标本中病毒核苷酸序列的同源性和构建系统进化树。

2 结果

2.1 汉坦病毒抗体检测、PCR扩增和病毒核苷酸同源性分析结果

在收集的临床高度怀疑为肾综合征出血热病人的126份血清标本中，其中的112份汉坦病毒IgM和(或)IgG抗体阳性，阳性率为88.9%。经PCR 扩增、测序和拼接，共获得7株汉坦病毒S基因完整的序列，命名为QDS01-QDS07。 经DNASta软件分析，QDS01-QDS07相互间序列达到68%-98.9%同源性。其中，QDS02与QDS04序列之间同源性高达98.9% 。详见图1。

图1 不同汉坦病毒青岛株S段核苷酸序列的同源性

2.2汉坦病毒青岛株S基因段系统发生树分析结果

经DNASta软件分析QDS01-QDS07汉坦病毒S基因序列，并与数据库中汉滩型(HTN，M14626)和汉城型(SEO，M34881)序列构建系统发生树，结果显示有两个分支，其中2株与汉滩型亲缘近，而另外5株与汉城型在一个分支。详见图2。

图2 汉坦病毒青岛株S段系统发生树

3 讨论

汉坦病毒是引起肾综合征出血热的主要病原体。其基因组由分别编码病毒RNA依赖的RNA多聚酶、病毒糖蛋白G1和G2以及病毒的核衣壳蛋白的L、M和S基因节段组成。除了与病毒感染和复制有关外，S基因序列具有相对的保守性，从而可对临床标本中获得的S段序列来分析汉坦病毒的进化、变异信息[2]。

我们对2013-2016年门诊和住院临床高度怀疑为肾综合征出血热的病人进行汉坦病毒IgM和IgG抗体的检测。在测定的126份样本中，其中112份呈现汉坦病毒IgM和(或)IgG抗体阳性，阳性率为88.9%。这表明青岛地区仍然是人肾综合征出血热发病的主要地区之一。

人感染肾综合征出血热病毒亚型与疫源地宿主携带的HV型别有关系。我国曾把HTN和SEO病毒称为“野鼠型”和“家鼠型”病毒，现已将“野鼠型”改为“姬鼠型”[3，5]。我们共获得7株汉坦病毒S基因完整的序列(QDS01-QDS07)，并将这些序列与数据库中汉滩型(HTN，M14626)和汉城型(SEO，M34881)序列构建系统发生树，结果显示有两个分支，其中2株与HTN亲缘近，而另外5株与SEO型在一个分支上。这与王慎骄等报道[4]江苏省肾综合征出血热病毒感染特点相一致，即青岛地区也是HV感染的混合疫区，同时存在HTN和SEO型汉坦病毒。核苷酸序列分析表明，7株间序列达到68%-98.9%同源性。在进化树分支上，5株与SEO型病毒标准株具有较近的亲缘关系，其中QDS02与QDS04之间同源性高达98.9%，这表明当地流行的SEO型病毒具有较高的遗传稳定性。

总之，研究表明引起青岛市流行性出血热的汉坦病毒为HTN型和SEO型的混合感染，以SEO型病毒为主，即“家鼠”作为携带SEO型病毒的主要宿主动物，可能是引起青岛地区人间流行性出血流行的主要因素之一，应引起注意。

[1]闭福银,谭 毅,莫建军,等.广西北部地区汉坦病毒基因型研究[J].应用预防医学,2016,22(05):383.

[2]CaoS,MaJ,ChengC,etal.GeneticcharacterizationofhantavirusesisolatedfromrodentsintheportcitiesofHeilongjiang,China,in2014[J].BMCVetRes,2016,12:12917.

[3]王玉兰,蔡 东,许 艳,等.日照平原地区鼠类及其携带汉坦病毒调查[J].中国国境卫生检疫杂志,2016,39(06):417.

[4]王慎骄,王笑辰,朱小娟,等.江苏省2009-2013年汉坦病毒分离株全基因序列测定及分析[J].南京医科大学学报(自然科学版),2015,35(11):1564.

[5]李 莉,张学军,杜月荷.连云港市2009年HFRS病例的流行特征和实验室检测结果分析[J].现代预防医学,2010,37(14):2741.

StudyonantibodydetectionsandgenotypesoftheHantavirusinQingdaodistrict,china

ZHUYuan-qi,JIANan,TIANQing-wu,etal.

(TheAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266003,China)

ObjectiveTo explore the genotype of hantavirus causing hemorrhagic fever with renal syndrome patients in Qingdao district,and to affirm genetic subtypes and its evolution features.MethodsHantavirus IgM ,IgG antibodies were detected by Diagnostic kit for antibody to Hantavirus (Colloidal Gold).The complete S segments were amplified by RT-PCR and sequenceing.The sequence percent identity and the phylogenetic tree were done by DNAStar Software so as to clarifying the characteristics of Hantavirus.ResultsOut of 126 blood samples collected from suspected acute hemorrhagic fever with renal syndrome patients ,112 samples were positive for IgM and/or IgG antibodies.Compared with standard strains of Hantavirus (HV)，the sequences analysis and phylogenetic tree indicated that the seven S genes amplified in antibody positive samples were grouped into two Hantaan virus (HTN) ,five Seoul virus(SEO),respectively． The sequence percent identity of all the 7 S genes were 68-98.9% homology.ConclusionOur results showed that there were two subtypes of HV(HTN and SEO) infections in Qingdao district and that SEO may be the dominant common hantanvirus.

Hantavirus;S gene;infection;Hantaan virus;Seoul virus

青岛市民生科技计划项目(14-2-3-12-nsh)

*通讯作者

1007-4287(2017)09-1314-03

R514.5

：A

2017-01-06)