趋化因子CXCL16及受体CXCR6在神经病理性疼痛小鼠背根神经节中的表达变化*

顾 军 高永静 姜保春

（南通大学航海医学研究所疼痛研究室，南通226019）

•论 著•

趋化因子CXCL16及受体CXCR6在神经病理性疼痛小鼠背根神经节中的表达变化*

顾 军 高永静 姜保春△

（南通大学航海医学研究所疼痛研究室，南通226019）

目的：检测神经病理性疼痛小鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)中CXC型趋化因子配体16 (C-X-C Motif Chemokine Ligand 16, CXCL16)及其受体CXCR6的表达情况，探讨CXCL16在疼痛的发生发展过程中所发挥的作用。方法：采用ICR小鼠进行坐骨神经分支选择性损伤(spared nerve injury, SNI)，诱导神经病理性疼痛，取术侧不同时间点L4～6节段DRG，通过实时定量PCR、Western Blot和免疫荧光的方法，检测SNI后CXCL16和CXCR6的mRNA和蛋白表达变化；鞘内注射CXCL16重组多肽，观察对疼痛行为的影响。结果：①SNI 3 d后可见小鼠DRG中Cxcl16 mRNA的表达显著增加(P＜ 0.001)，可持续至14 d (P＜ 0.001)， SNI后7 d CXCL16蛋白表达也显著增加(P＜ 0.05)，免疫荧光结果表明CXCL16主要分布在DRG中小型神经元中；②CXCR6的mRNA和蛋白在SNI 7 d显著增加(P＜ 0.05)；③鞘内注射CXCL16多肽引起小鼠机械性触诱发痛。结论：外周神经损伤诱导CXCL16和CXCR6在DRG表达增加，CXCL16能够导致痛觉过敏，提示它可能在神经病理性疼痛中发挥作用。

神经病理性疼痛；背根神经节；趋化因子；CXCL16；CXCR6

神经病理性疼痛是由原发性神经系统损害或功能障碍引起的疼痛，目前发病机制还不完全清楚，临床治疗药物疗效有限，而且许多病人需要忍受长期的药物副作用，成为临床上一种难治的疾病。开发新的治疗手段和药物需要对神经病理性疼痛发病机制做深入研究，寻找新治疗靶点。疼痛是宿主防御机制的一个主要组成部分，也是炎症反应的一个重要特征，反之，促炎介质也有可能导致疼痛发生[1]。近年有大量研究表明神经病理性疼痛与炎症相关，尤其是在背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)和脊髓节段[2]。当外周神经损伤后，背根神经节中的卫星胶质细胞、神经元和外周浸润的T细胞、巨噬细胞分泌的细胞因子和趋化因子作用在其受体后能够改变DRG神经元的离子通道活性和兴奋性，介导慢性疼痛的发生和维持[2,3]。例如，完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant, CFA)能够诱导DRG神经元中CXC型趋化因子配体13 (C-X-C Motif Chemokine Ligand 13, CXCL13)和它的受体CXCR5表达升高，CXCL13/CXCR5轴激活后能够促进促细胞分裂原活化蛋白激酶p38磷酸化，进而增强电压门控钠离子通道1.8 (Voltage-Gated Sodium Channel Subunit Alpha 1.8, NaV1.8) 电流，引起痛觉过敏[4]。Zhang等研究发现DRG神经元中有CCL3和其受体CCR1的表达，当CCL3/CCR1轴激活后能够增强TRPV1对辣椒素的响应，增强胞内钙信号，小鼠鞘内注射CCL3显著降低热板反应的潜伏期[5]。化疗药紫杉醇可诱导DRG神经元中CX3CL1表达升高，引起巨噬细胞浸润和机械性痛觉过敏[6]。CXCL16是CXC超家族的一员。CXCR6是CXCL16的唯一受体，属G蛋白偶联受体家族。CXCL16与CXCR6结合后，可调控免疫系统发育[7]、血管生成[8]、肿瘤恶化[9]、免疫炎症细胞募集和激活[10]等生物过程。为了明确CXCL16和CXCR6在神经病理性疼痛中在DRG的表达和作用，本研究采用小鼠坐骨神经分支选择性损伤 (spared nerve injury, SNI) 模型，观察CXCL16和CXCR6在DRG中的表达时程和定位，验证当CXCL16/CXCR6轴激活后对疼痛行为的影响，探讨其作为疼痛治疗靶点的可能性，丰富疼痛调控机制理论。

方 法

1.材料

动物：健康成年雄性ICR小鼠，由南通大学动物实验中心提供。

试剂和药品：CXCL16抗体和CXCR6抗体（武汉博士德公司）； CXCL16 重组多肽（美国PeproTech）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（美国Thermal Scienti fi c）；TRIzol试剂（美国Invitrogen）；逆转录酶和SYBR Premix Ex Taq II（日本Takara）；Cy3标记的荧光二抗（美国Jackson）；其余化学试剂由美国sigma公司提供。

实验所用主要仪器：荧光定量PCR仪Light-Cycler96（瑞士Roche）；电泳仪（美国Bio-Rad）；正置荧光显微镜DM4000B（德国Leica）；Odyssey双色红外荧光扫描仪（美国LI-COR）；多功能酶标仪（美国BioTek）。

2.方法

（1）SNI疼痛模型建立

采用Decosterd和Woolf建立的SNI[11]外周神经损伤疼痛模型。ICR小鼠经复合麻药腹腔注射麻醉后，剃毛消毒，沿胫骨切开皮肤，钝性分离肌肉组织，用玻璃分针找到胫神经和腓总神经，将二者结扎后于远中枢端剪断，保持完整的腓肠神经，逐层缝合肌肉、筋膜和皮肤，消毒后放至温暖处等待小鼠苏醒。假手术组操作过程同上，但不结扎和剪断神经。

（2）行为学实验测定

在室温下将小鼠放置机械痛行为测定架上适应至安静，连续3天，适应时应禁食、禁水，时间在09:00～17:00，适应结束用von Frey fi lament进行小鼠爪底刺激。机械痛测定采用Dixon建立的“up and down”方法，用von Frey fi lament检测小鼠爪底阈值，先使用0.16 g 的von Frey fi lament 刺激小鼠爪底，观察缩爪反应，如果5次中有3次及以上出现缩足、甩足、舔足，则记为疼痛X，反之为O；如果是X，则选用小一级的von Frey fi lament刺激爪底，反之则选用大一级的von Frey fi lament刺激。最大级von Frey fi lament为2.0 g，最小级von Frey fi lament为0.02 g。最后得到一组数据，一般为6个字符(如OOXOXO)或者5个字符的OOOOO和4个字符的XXXX，换算后得到缩爪阈值Paw withdrawal threshold (g)。缩爪阈值越低，表示痛觉过敏越严重。

（3）实时荧光定量PCR

小鼠经异氟烷麻醉后用20 ml生理盐水心脏灌流，取L4-6DRG。TRIzol法提取总RNA，测定浓度后将1 µg RNA逆转为cDNA，在LightCycler 96中进行实时PCR反应。引物序列由Invitrogen公司合成：CXCL16 Forward 5'- ATA CCG CAG GGT ACT TTG GAT-3'，Reverse 5'-CTG CAA CTG GAA CCT GAT AAA GA-3'；CXCR6 Forward 5'-GAG TCA GCT CTG TAC GAT GGG-3'，Reverse 5'- TCC TTG AAC TTT AGG AAG CGT TT-3'；GAPDH Forward 5'- AAA TGG TGA AGG TCG GTG TGA AC -3'，Reverse 5'- CAA CAA TCT CCA CTT TGC CAC TG-3'。PCR扩增条件为：预变性（95℃，600 s）；扩增循环45次，（95℃，10 s；60℃，10 s；72℃，10 s）；溶解（95℃，10 s；65℃，60 s；97℃，1 s）。

（4）Western Blot 蛋白分析

小鼠灌注取材同PCR分析。加入RIPA裂解液70 µl裂解DRG组织，冰上电动匀浆后在冰上静置30 min。4℃，15 000 rpm 离心18 min，吸取上清，即得蛋白溶液。所得蛋白经双蒸水稀释8倍后，用BCA法测定蛋白浓度。每孔加入30 µg蛋白进行电泳，湿法转膜将蛋白转移到PVDF膜上；5% BSA室温封闭2 h，4℃一抗过夜孵育（CXCL16，1:200；CXCR6，1:500）；次日室温复温1 h后TBST洗3次，每次15 min；用5% BSA稀释荧光二抗，室温孵育2 h；TBST洗3次，每次15 min，显影。

（5）免疫荧光

小鼠经异氟烷吸入麻醉后，用4% 多聚甲醛灌注固定。取小鼠L5-DRG，4% 多聚甲醛后固定2 h，再先后于20%、30%蔗糖溶液中脱水沉底，冰冻切片机切片，厚度为14 µm。免疫荧光染色：PBS (0.01M，pH值7.4)洗片3次，每次20 min；加5%羊血清室温封闭2 h；加一抗(CXCL16，1:200, 博士德；CXCR6，1:500，博士德；CGRP,1:5 000, Sigma-Aldrich；NF200，1:500，Millipore；IB4，1:50，Sigma-Aldrich)，4℃过夜孵育；次日复温至室温后PBS洗3次，每次15 min；分别加入Cy3和 Alexa 488标记的荧光二抗(1:1 000，Jackson ImmunoResearch)；室温孵育2 h，PSB洗3次，每次20 min，晾干，封片剂封片；正置荧光显微镜下拍照观察。

（6）图像和统计学处理

荧光实时定量PCR采用2-△△CT方法分析。用ImageJ软件分析目的蛋白和内参蛋白的平均光密度值，比值作为各组蛋白相对表达量。采用Twoway repeated measures ANOVA分析行为学结果。分别用One-way ANOVA和 Student'st-test方法分析定量PCR和Western Blot结果。数据表示采用均数±标准误(±SEM)，P= 0.05为统计学临界值。

结 果

1.坐骨神经分支选择性结扎（SNI）可显著降低小鼠机械痛阈。

在SNI术后第1d、3d、7d，14d采用von Frey fi lament检测同侧小鼠爪底阈值。结果显示，与对照组相比，手术组小鼠在1d (P＜0.01)、3d(P＜0.001)、7d (P＜0.01)、14d(P＜0.001)的机械性缩爪阈值显著降低（见图1），假手术组无显著变化。

2.SNI诱导小鼠背根神经节中趋化因子CXCL16和CXCR6的 mRNA和蛋白表达升高。

（1）采用Real-time PCR的方法检测ICR小鼠SNI后各时间点趋化因子CXCL16的mRNA在L4-6节段DRG中的表达。结果显示，与Naive组相比，手术组CXCL16 mRNA在术后第3 d、7 d、14 d表达显著增加(P＜ 0.001，见图2A)；Western Blot结果显示，SNI术后7 d小鼠L4-6节段DRG中的CXCL16蛋白显著高于Naive组小鼠(P＜ 0.05, 见图2B)。免疫组化染色进一步观察了SNI后7天同侧DRG中的CXCL16的表达和分布，与Naive组小鼠相比，CXCL16表达明显增强（见图2C，D）。

（2）我们还用免疫荧光双标的方法确定了CXCL16在DRG神经元中的分布，结果表明，CXCL16主要分布于IB4和CGRP阳性的中小型神经元中（见图3A-F），在NF200阳性的中大神经元中有少量分布（见图3G-I）。

（3）SNI上调CXCR6在DRG中的表达。结果显示，与Naive组相比，手术组CXCR6 mRNA在术后第7 d表达显著增加(P＜ 0.05, 见图4A)；CXCR6分析方法同CXCL16。结果显示，SNI术后CXCR6蛋白显著高于Naive组小鼠(P＜ 0.05, 见图4B)。免疫组化染色结果进一步验证CXCR6蛋白在SNI术后表达增加，主要定位于神经元中（见图4C，D）。

图1 SNI诱导小鼠同侧足底机械性痛觉过敏，SNI后第1天开始产生机械痛觉过敏，可持续到14 d（n= 6,±SEM）**P＜0.01, ***P＜0.001, 与 Sham 组相比Fig.1 SNI induced rapid and persistent mechanical allodynia on the ipsilateral plantar surface.SNI induced mechanical allodynia at days 1, 7, 10, and 14 d.Data were expressed as± SEM,n= 6.**P＜ 0.01, ***P＜0.001, compared with sham group, Two-way repeated measures ANOVA.

图2 SNI上调CXCL16在DRG中的表达(± SEM)A：CXCL16 mRNA 在SNI小鼠DRG中表达(n= 8, ***P＜0.001, 与Naive相比，One-way ANOVA)。B：Western Blot检测SNI 7天DRG中CXCL16表达，显著高于对照组(n= 3～4, *P＜0.05， 与Naive相比，Student's t-test)。C，D：免疫荧光显色显示SNI 7天同侧DRG中CXCL16蛋白的表达分布，标尺= 100 µmFig.2 CXCL16 was upregulated in DRG neurons after SNI (± SEM)A：SNI increased the expression of Cxcl16 mRNA at 3 days, 7days, and 14 days compared with naive mice.***P＜ 0.001, One-way ANOVA.B：Western blot shows increased CXCL16 protein levels in the ipsilateral DRG after SNI (n= 3), compared with naive (n= 4)animals.*P＜0.05, Student's t test.C, D：Representative images of CXCL16 immuno fl uorescence in the DRG from naive and SNI mice.CXCL16 IR was low in naive mice (C), but was increased in the ipsilateral DRG of SNI mice (D).Scale bar = 100 µm

3.正常小鼠鞘内注射重组CXCL16因子能诱导产生痛觉过敏。

正常ICR小鼠鞘内注射重组CXCL16因子显著降低小鼠机械性痛觉过敏。鞘内注射重组CXCL16因子（每只100 ng/10 µl）后，CXCL16组小鼠机械性缩爪阈值在1 h (P＜ 0.05)、3 h (P＜ 0.01)、6 h (P＜ 0.01)和24 h (P＜ 0.01)后显著降低，而注射溶剂组无显著变化（见图5）。

讨 论

图3 CXCL16 在DRG神经元中分布免疫荧光双标结果显示CXCL16与IB4 (A-C)、CGRP (D-F)和NF200 (G-I)的共定位情况，标尺= 50 µmFig.3 The cellular distribution of CXCL16 in the DRG Double staining of CXCL16 with IB4 (A-C), CGRP (D-F), and NF 200 (G-I) in the DRG, Scale bar = 50 µm

图4 SNI上调CXCR6在DRG中的表达(n=8,± SEM)A：CXCR6 mRNA 在SNI后DRG中表达时程(n=8, *P＜0.05, 与Naive相比, One-way ANOVA)。B：Western Blot检测SNI 7天DRG中CXCR6表达，显著高于对照组(n=3, *P＜0.05, 与Naive相比, Student's t-test)。C，D：免疫荧光显色显示SNI 7天DRG中CXCR6蛋白的表达分布，标尺= 100 µmFig.4 CXCR6 was upregulated in the DRG after SNI (n=8,± SEM)A：SNI increased Cxcr6 expression at 7 days compared with naive mice.*P＜0.05, One-way ANOVA.B：Western blot shows that SNI increased CXCL16 protein levels in the ipsilateral DRG (n= 3) compared with naive (n= 3) animals.*P＜0.05, Student's t test.C, D：Representative images of CXCR6 immuno fl uorescence in the DRG from naive and SNI mice.CXCR6 IR was low in sham mice (C), but was increased in the ipsilateral DRG of SNI mice (D).Scale bar = 100 µm

图5 鞘内注射CXCL16能够诱导小鼠在1 h、3 h、6 h和24 h产生显著的机械性痛觉过敏(n= 6 ～ 7,±SEM)*P＜ 0.05, **P＜ 0.01, 与 Vehicle组相比 , Two-way repeated measures ANOVAFig.5 Intrathecal injection of CXCL16 induced mechanical allodynia 1, 3, 6, and 24 hours after injection, compared with vehicle group mice.Data are expressed as±SEM(n= 6 ～ 7,± SEM)for each group. *P＜0.05, **P＜0.01.

研究采用Decosterd和Woolf建立的SNI外周神经损伤疼痛模型。SNI模型损伤胫骨神经和腓总神经，保持完整的腓肠神经，可诱导小鼠产生快速持续的机械性痛觉过敏，但热痛觉过敏不明显。该疼痛模型具有创伤小、疼痛行为发生快、外周敏化范围广、机械性痛敏比SNL和CCI模型敏感等优点[11]。本研究利用ICR小鼠成功建立了SNI疼痛模型，在术后1 d就诱导产生了显著的机械性痛觉过敏，机械性疼痛阈降到0.1 g以下，并且可以在该水平下维持到14 d；各时间点热痛觉阈值变化不大（数据未提供），这与文献报道中提到的结果一致。

当外周神经损伤诱导的疼痛模型中，相同的趋化因子和其受体可在DRG和脊髓节段同时出现表达异常例如CXCL13和其受体CXCR5[4,12]， CCL2和其受体CCR2等。实验室前期基因芯片检测外周神经损伤后脊髓内基因表达谱发现CXCR6是外周神经损伤后脊髓中高表达基因之一。CXCL16是CXCR6的唯一配体，那么CXCL16和CXCR6是否在DRG中表达，表达于何种类型的细胞，以及是否参与神经病理性疼痛的调控还未见报道。为了解决上述问题，本研究对CXCL16及其受体CXCR6的表达分布和对疼痛行为的影响进行了研究，以望能确定一个新的疼痛治疗靶点。结果发现SNI可诱导小鼠DRG神经元中CXCL16和CXCR6表达增高。DRG是伤害性感觉神经元聚集的场所，也是痛觉信息进行第一级调制的部位，在神经病理性疼痛的外周机制中具有重要作用[13]。SNI后小鼠DRG中的CXCL16和CXCR6表达升高预示着CXCL16可能和DRG外周敏化相关，参与疼痛的调制过程。经过对SNI后CXCL16的表达时程分析，发现从第3 d开始其表达显著升高，并持续到14 d仍未降低，提示CXCL16可能在神经病理性疼痛的产生和维持过程中都发挥了作用。免疫荧光双标分析发现CXCL16主要分布于DRG的中、小型神经元，进一步证实CXCL16可能参与慢性疼痛的调制，但具体和哪一类神经元相关、影响了哪些信号通路和离子通道的功能还需进一步的研究。

免疫学结果显示CXCL16和CXCR6都定位在DRG神经元中，这与已发现的一些介导疼痛的趋化因子和其受体分布方式类似，这类趋化因子和其受体可能介导了DRG内不同神经元之间或者同种神经元之间的信息交流。例如，CXCL13和CXCR5可同时表达于DRG神经元中，疼痛状态下CXCL13/CXCR5轴激活，影响神经元上Nav1.8通道活性，促进痛觉过敏的发生[4]。有可能CXCL16/CXCR6在DRG中也有着类似的作用机制，需做进一步研究。

正常小鼠鞘内给予CXCL16因子后小鼠机械痛阈值显著降低，能够维持24 h以上，这表明CXCL16因子具有较强的致痛作用，其作用时间长于CXCL13和CCL2等趋化因子[12]，同时表明CXCR6组成性表达即可介导疼痛的发生，这可能与其组成性表达较高有关，因为CXCR6表达在SNI 7天后才显著上升，且上升速度和幅度要弱于CXCL16。

综上所述，外周神经损伤后L4-6段DRG神经元中CXCL16和CXCR6表达显著升高。鞘内注射CXCL16诱导机械性痛觉过敏提示CXCL16/CXCR6有助于神经病理性疼痛的产生和维持。尽管鞘内注射CXCL16因子诱导产生痛觉过敏，但不能充分说明CXCL16和CXCR6在神经病理性疼痛中发挥的作用，接下来将用特异性抑制剂、基因敲除小鼠或RNA干扰等技术对CXCL16及CXCR6在神经病理性疼痛中的作用和机制做深入研究，加深人们对趋化因子介导神经病理性疼痛机制的理解，为疼痛治疗提供有潜力的新靶点。

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THE EXPRESSION OF CXCL16 AND ITS RECEPTOR CXCR6 IN THE DRG IN A MICE MODEL OF NEUROPATHIC PAIN*

GU Jun, GAO Yong-Jing, JIANG Bao-Chun△
(Pain Research Laboratory, Institute of Nautical Medicine, Nantong University, Nantong 226019, China)

Objective:To detect the expression of CXCL16 and its receptor CXCR6 in the dorsal root ganglia(DRG) of mice with peripheral nerve injury, and to investigate whether CXCL16 mediates pain hypersensitivity.Methods:The spared nerve injury (SNI) model was used to induce neuropathic pain in mice.The expression of CXCL16 and its receptor CXCR6 were detected by real-time PCR, western blot and immuno fl uorescence staining.The contribution of CXCL16 to pain hypersensitivity was evaluated by intrathecal injecting of recombinant CXCL16.Results:①SNI increased the expression of Cxcl16 mRNA at 3 days, 14 days and 21 days in the DRG.CXCL16 protein level was signi fi cantly increased 7 days after SNI.Immuno fl uorescence staining showed that CXCL16 was mainly localized in small and medium-size DRG neurons; ②SNI induced upregulation of Cxcr6 mRNA and protein level at 7 days; ③Intrathecal injection of CXCL16 was suf fi cient to induce mechanical allodynia.Conclusion:CXCL16 and CXCR6 were persistently upregulated in the DRG after SNI.Intrathecal CXCL16 induced pain hypersensitivity.Hence, CXCL16 may be involved in neuropathic pain.

Neuropathic pain; Dorsal root ganglion; Chemokine; CXCL16; CXCR6

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.08.004

国家自然科学基金(31371121, 81400915)；江苏省自然科学基金(BK20140427)；江苏省科研创新计划项目（KYLX16_0980)；南通大学科研创新计划项目（YKC16021）

△通讯作者 jiangbaochun@ntu.edu.cn