优化Fe-CA仿酶合成工艺研究

赵士举，魏登辉，常安然，张 耸，刘小勇，于建军

(1. 河南农业大学理学院, 河南 郑州 450002； 2. 河南农业大学烟草学院, 河南 郑州 450002)

优化Fe-CA仿酶合成工艺研究

赵士举1，魏登辉2，常安然2，张 耸2，刘小勇1，于建军2

(1. 河南农业大学理学院, 河南 郑州 450002； 2. 河南农业大学烟草学院, 河南 郑州 450002)

为了减少梗丝中木质素含量，改善梗丝的品质，提高其在卷烟中的应用，对Fe-CA仿酶合成的4个影响因素(摩尔配比、反应温度、反应时间、pH)进行单因素试验和正交试验优化，并将合成的Fe-CA仿酶对梗丝进行木质素降解，对处理前后的梗丝进行电镜扫描，并将其制成单料烟进行感官评价。结果表明，最佳合成方案条件是n(Fe2+)∶n(柠檬酸)为1∶1，反应温度是60 ℃，反应时间是40 min，pH值为6.0，此时合成率为82.1%；Fe-CA仿酶处理后的梗丝，木质素含量由3.49%降至1.60%，去除率达54.15%；Fe-CA仿酶处理后的梗丝表面变得更加齐整光滑，毛突减少；与对照相比，试验卷烟的香气质和香气量得到了改善，木质杂气减少，刺激性降低，品质得到提升。

梗丝；仿酶；木质素；卷烟；感官评价

中国是烟草种植大国，每年都会有大量烟梗产生。如何有效利用烟梗，近年来有很多研究机构对此进行了一些有意义的研究，如龚德鸿等[1]通过热解的方式将生烟梗转化为生物油，还有人将烟梗膨胀制成梗丝添加到卷烟中。由于烟梗的主要成分是木质素、纤维素和半纤维等，其中木质素燃烧时有木质气并产生灼喉感，限制了烟梗在卷烟行业中的使用，因此，可以通过减少烟梗中的木质素来改善烟梗在卷烟中的使用效果。关于木质素的降解方法主要有物理、化学及生物法等，如李力等[2]用蒸汽爆破的方法处理烟梗，从而使烟梗的木质素含量减少；郭刚等[3]通过利用稀NaOH溶液与酶联用的方式来处理烟梗,结果表明，烟梗木质素降解30%，烟梗内在品质得到提升；林凯等[4]用生物酶对梗丝进行处理，使梗丝木质素含量减少，梗丝品质得到提升。 仿酶是既有酶的功能又比酶简单稳定的非蛋白质分子或分子集合体, 兼有天然酶催化与化学催化的优点, 其中铁系仿酶中的Fe-羧酸复合物(Fe-CA)体系对天然植物原料中木质素的脱除具有良好的选择性[5-7]。迄今为止,对Fe-CA仿酶合成工艺的优化及其在梗丝降解过程中的应用研究鲜有报道，本研究选择Fe-CA仿酶对梗丝中的木质素进行脱除,然后将降解后的梗丝用到卷烟生产上，以改善烟梗对卷烟的感官质量造成不佳抽吸的状况。

1 材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

梗丝(河南地区)、98 %浓硫酸(AR，烟台市双双化工有限公司)、柠檬酸(AR，天津市永大化学试剂有限公司)、FeSO4·7H2O(AR，天津市永大化学试剂有限公司)、95 %无水乙醇(AR，天津市永大化学试剂有限公司)、邻二氮菲(AR, 德州润昕实验仪器有限公司)

四口瓶(250 mL,北京博美BOMEX玻璃仪器)、电热恒温水浴锅(HH·SY21-Ni,北京市长风仪器仪表有限公司)、恒温恒湿箱(澳德玛HWHS-100HC，深圳市澳德玛科技有限公司)、扫描电子显微镜(日本，JSM-6490LV)、双光束紫外可见分光光度计(TU-1901，北京普析通用仪器有限责任公司)、傅里叶红外光谱仪(IR-960, 天津瑞岸科技有限公司)等。

1.2Fe-CA仿酶的合成

取0.01 mol柠檬酸加入适量蒸馏水溶解转移至250 mL 四口瓶中，同时加入少量铁粉做抗保护剂，在通入高纯氮气保护下将四口瓶放入恒温水浴中低速搅拌10 min ；加入0.01 mol的硫酸亚铁，待硫酸亚铁完全溶解后，用氢氧化钠溶液调节四口瓶中反应溶液pH值至试验设计值。开始计时，反应结束后，将反应后溶液转移至烧杯中，加入一定量的无水乙醇，搅拌5～10 min，析出螯合物，过滤并用无水乙醇洗涤沉淀物2～3次，低温真空干燥得到Fe-CA仿酶样品。其余按表1做正交试验[8-12]。

1.3Fe-CA仿酶单因素试验

主要选取Fe2+与柠檬酸配比、反应温度、反应时间、pH值4个因素考察Fe-CA仿酶合成的最佳条件，水平梯度设为n(Fe2+)：n(柠檬酸) 分别为1∶1，1∶2，1∶3，1∶4和1∶5，反应温度设为30，40，50，60和70 ℃，反应时间设为20，30，40，50和60 min，pH值设为3.0，4.0，5.0，6.0和7.0。

1.4Fe-CA仿酶正交试验

在单因素试验的基础上，用DPS统计软件设计Fe-CA仿酶合成正交试验，试验选取n(Fe2+)：n(柠檬酸)(1∶1，1∶2和1∶3)(A)、反应温度(40，50和60℃)(B)、反应时间(30，40和50 min)(C)和pH值(4.0，5.0和6.0)(D)为因素，设计成4因素3水平9处理试验。正交试验设计如表1所示。

表1 正交试验设计Table 1 Orthogonal experimental design

1.5Fe-CA仿酶合成率的测定

通过检测水样在510 nm 处的吸光值，对照标准曲线，得到水样中Fe2+浓度与吸光值的关系曲线，计算出合成物产品中亚铁的含量，对比初始反应时加入的亚铁离子的量，得出Fe-CA仿酶合成率[8]。

1.6Fe-CA仿酶处理前后梗丝的红外光谱测定

先称取Fe-CA仿酶0.001 g,再称取溴化钾0.1 g，烘干后混匀，用研钵研碎，经过压片后，在傅里叶红外光谱仪上测Fe-CA仿酶的图谱。同理，经溴化钾压片后测柠檬酸的红外光谱图[13]。

1.7Fe-CA仿酶在梗丝木质素降解中的应用

将一定量的Fe-CA仿酶溶解到纯水中，制成Fe-CA仿酶溶液，用小型喷雾器将Fe-CA仿酶溶液喷洒到梗丝上，之后将处理过的梗丝装入自封袋中，放入恒温恒湿箱中(温度35 ℃，湿度65%)处理30 min进行酶解，之后将梗丝烘干。采用烟草行业标准方法YC/T 347—2010[14]测定梗丝中木质素含量(即用酸性洗涤剂除去糖类、蛋白质、半纤维素及脂肪等成分后，再以72%硫酸处理，最后测定酸不溶木质素的含量)。设降解前的梗丝木质素含量为X1，降解后的梗丝木质素含量为X2，梗丝木质素降解率为(X1-X2)/X1×100%。

1.8Fe-CA仿酶处理前后梗丝的评吸

将经Fe-CA仿酶处理后的梗丝，放在温度(22±1)℃和相对湿度(60±2)%的恒温恒湿箱中平衡48 h，用填烟器分别将经过Fe-CA仿酶处理和未经过Fe-CA仿酶处理的梗丝制成烟支(每支约为1 g，每个样10支)，放入恒温恒湿箱中继续平衡48 h，由郑州卷烟厂的卷烟感官评吸专家小组(7人)进行评吸[15-16]。

2 结果与分析

2.1Fe-CA仿酶合成单因素试验

2.1.1n(Fe2+)∶n(柠檬酸)对Fe-CA仿酶合成率的影响 在初始条件pH值6.0，反应温度50 ℃，反应时间40 min下，考察不同Fe2+与柠檬酸摩尔配比对Fe-CA仿酶合成率的影响，结果如图1所示。在Fe2+不变，柠檬酸逐渐增加的过程中，Fe-CA仿酶的合成率逐渐减低，这说明n(Fe2+)∶n(柠檬酸)为1∶1时为最佳配比。

图1 配比对Fe-CA仿酶合成率的影响Fig.1 Effect of coordination ratio on the synthesisrate of Fe-CA biomimetic enzyme

2.1.2 反应温度对Fe-CA仿酶合成率的影响 在初始pH值6.0，n(Fe2+)∶n(柠檬酸)为1∶1，反应时间40 min的情况下，改变温度进行试验，探讨反应温度对Fe-CA仿酶合成率的影响，结果如图2所示。随着反应温度的升高，Fe-CA仿酶的合成率呈先升高后降低的趋势，这可能是随着反应温度的增加，逆反应趋势增大的造成的,在50 ℃时合成率达到最大。

图2 反应温度对仿酶合成率的影响Fig.2 Effects of reaction temperature on thesynthesis rate of Fe-CA biomimetic enzyme

2.1.3 反应时间对Fe-CA仿酶合成率的影响 在初始pH值6.0，n(Fe2+)∶n(柠檬酸)为1∶1，反应温度50 ℃的情况下，改变反应时间，探讨反应时间对Fe-CA仿酶合成率的影响，结果如图3所示。随着时间的增加，合成率先增大后减小，反应时间为40 min时合成率达最大值。

图3 反应时间对Fe-CA仿酶合成的影响Fig.3 Effects of reaction time on the synthesisrate of Fe-CA biomimetic enzyme

2.1.4 pH值对Fe-CA仿酶合成率的影响 在n(F2+e)∶n(柠檬酸)为1∶1，反应温度50 ℃，反应时间 40 min的情况下，改变反应的pH值，来探讨反应pH对Fe-CA仿酶合成率的影响，结果如图4所示。随着反应溶液pH值的增大，Fe-CA仿酶合成率先增大后降低，在pH值5.0时，合成率最大。

图4 pH值对Fe-CA仿酶合成的影响Fig.4 Effects of pH on the the synthesisrate of Fe-CA biomimetic enzyme

2.2Fe-CA仿酶合成的正交试验

在单因素试验的基础上进行正交试验，从而找出Fe-CA仿酶合成的最佳试验方案，正交试验设计结果如表2所示。 由表2可知，Fe-CA仿酶合成的最佳工艺条件是A1B3C2D3,即最佳合成方案条件是n(Fe2+)∶n(柠檬酸)为1∶1，温度是60 ℃，时间是40 min，pH为6.0。由表2试验结果中的极差R大小可知，影响Fe-CA仿酶合成率大小的影响因素主要是配比，然后是反应时间，其次是反应温度和溶液的pH值。

因此, 综合以上正交试验，确定n(Fe2+)∶n(柠檬酸)为1∶1，反应温度60 ℃, 反应时间40 min, pH值为6.0时为最佳合成工艺条件。

表2 正交试验设计结果Table 2 Result of orthogonal experimental

注：K1,K2,K3是均值，R是极差。

Note:K1,K2,K3indicate mean,Ris range.

2.3Fe-CA仿酶和柠檬酸的红外光谱对比

经过溴化钾压片测得Fe-CA仿酶和柠檬酸的红外光谱图，结果如图5所示。从Fe-CA仿酶红外图谱可以看出，Fe-CA仿酶在1 641.39 cm-1和1 384.39 cm-1处有吸收峰，说明此两处有CO，前者为反对称伸缩振动，后者为对称伸缩振动，其中1 641 cm-1处为配位羧基的特征吸收峰，表明了硫酸亚铁和多元羧酸的羧基发生了配位反应。对照柠檬酸红外光谱图，其中1 700.27和1 755.36 cm-1处 的自由羧基吸收峰消失，表明硫酸亚铁和多元羧酸反应完全，形成晶体[7-8]。

图5 Fe-CA仿酶和柠檬酸红外图谱Fig.5 Infrared spectrum of Fe-CA and citric acid

2.4Fe-CA仿酶降解梗丝木质素试验

用烟草行业标准法测梗丝木质素含量，木质素质量分数的计算公式：X/%=m1/m0×100%，公式中，m1为烘干后的木质素质量(g)；m0为绝干试样的质量(g)。测得梗丝降解前的木质素含量为3.49 %(m1为0.034 9g,m0为1 g)，经Fe-CA仿酶降解后梗丝的木质素含量为1.60 %(m1为0.016g,m0为1 g)，降低了54.15 %，表明Fe-CA仿酶对梗丝木质素有较好的降解作用。

将经Fe-CA仿酶处理前后的梗丝样品分别切片，然后在SEM电镜下观察，结果见图6。由图6可知，经Fe-CA仿酶处理后的梗丝表面比未处理的梗丝表面变得更加齐整光滑，毛突减少，说明梗丝经Fe-CA仿酶处理后木质素降解较好。

2.5Fe-CA仿酶处理前后梗丝表面评吸结果分析

对加Fe-CA仿酶处理的梗丝与经Fe-CA仿酶处理的梗丝分别进行评吸，结果见表3。由表3可知，加Fe-CA仿酶处理的梗丝，卷烟烟气的香气质、香气量得到提高，余味改善，烟气中的杂气、刺激性降低；但烟气浓度、劲头、燃烧性及灰色则无明显变化。

图6 Fe-CA仿酶处理前后烟梗丝表面SEM图(×200)Fig.6 SEM map of cut stem before and after treatment with Fe-CA biomimetic enzyme

3 结论与讨论

通过正交试验优化了Fe-CA仿酶合成工艺条件，当反应条件是n(F2+e)∶n(柠檬酸)为1∶1，反应温度是60 ℃，反应时间是40 min，pH值为6.0，合成效果最好。通过对比Fe-CA仿酶和柠檬酸的红外光谱图确认了硫酸亚铁与柠檬酸合成了晶体。用合成的Fe-CA仿酶来处理梗丝中的木质素，木质素含量由原来的3.49 %降到1.60 %，降低了54.15 %。文献[17]中以过氧化氢和氢氧化钾溶液处理梗丝，梗丝木质素含量降低43.5%。易聪华等[18]用氧碱法处理烟梗，烟梗中木质素含量降低47.9%。可见，用本方法合成的Fe-CA仿酶对梗丝木质素的降解效果较好。分别对降解后的梗丝和未降解的梗丝进行评吸，结果表明，经过Fe-CA仿酶处理的梗丝，在香气、杂气、刺激性和余味方面得到了改善，卷烟品质得到提升。

[1] 龚德鸿，许成，顾红艳. 烟梗的热解特性分析[J]. 贵州大学学报(自然科学版), 2011, 28(4): 33-36.

[2] 李力, 李东亮, 冯广林, 等. 蒸汽爆破技术在烟梗加工中的应用[J]. 烟草科技, 2013, 46(1): 42-45.

[3] 林凯. 酶法对烟梗丝降解效果的研究[J]. 安徽农业科学, 2011, 39(11): 6500-6501.

[4] 郭刚. 弱碱与酶联用对烟梗品质的影响[J]. 安徽农业科学, 2012, 40(30): 14982-14983.

[5] 毛耀, 刘志昌, 姚元军,等. 烟草木质素的Fe-CA仿酶降解[J]. 烟草科技, 2011, 44(6): 48-51.

[6] ZI W H, ZHANG X L, PENG J H, et al. Optimization of microwave drying biomass material of stem granules from waste tobacco using response surface methodology[J]. Drying Technology, 2013,31(11): 1234-1244.

[7] 臧亚楠, 孔宁川, 李青青,等. 烟草木质素的研究概况[J]. 云南农业大学学报, 2015,30(5): 822-828.

[8] 刘廷志, 周盼丽, 李丽娟, 等. Fe-CA仿酶氧化催化剂的合成及其在造纸终端混合废水处理上的应用[J].纸和造纸, 2015, 34(7): 49-52.

[9] 马明玉. Fe-CA仿酶降解木素机理及深度处理造纸中段废水的研究[D]. 济南: 山东轻工业学院，2011.

[10] 高洪贵, 谢益民, 孙媛芳. Fe-CA仿酶-混凝法处理造纸综合废水[J]. 造纸科学与技术, 2008, 27(3): 10-12.

[11] 高洪贵, 谢益民, 孙媛芳. Fe-CA仿酶-混凝法处理麦草化机浆综合废水的研究[J]. 中国造纸学报, 2009, 24(1): 68-71.

[12] 帅兴华. 仿酶氧化与絮凝在造纸废水处理中的应用研究[D]. 济南: 山东轻工业学院，2007.

[13] 刘约全. 现代仪器分析[M]. 北京: 高等教育出版社, 2006.

[14] YC/T 347-2010 烟草及烟草制品 中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、酸洗木质素的测定 洗涤剂法[S].

[15] 于建军. 卷烟工艺[M]. 北京: 中国农业出版社, 2009.

[16] 魏鹏程. 辛夷致香物质提取分离及在卷烟中的加香应用[D]. 郑州: 河南农业大学, 2013.

[17] 英美烟草(投资)有限公司. 减少烟草中含氮化合物和木质素的方法: 英国, CN100334978C[P]. 2007-09-05.

[18] 易聪华, 张素文, 戴唯妮, 等. 氧碱法脱除烟梗中木质素降低烟气有害成分[J]. 华南理工大学学报(自然科学版), 2016, 44(6): 21-26.

(责任编辑：常思敏)

OptimizationofthesynthesisprocessofFe-CAbiomimeticenzyme

ZHAO Shiju1, WEI Denghui2, CHANG Anran2, ZHANG Song2, LIU Xiaoyong1, YU Jianjun2

(1. College of Sciences , Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China； 2. College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

In order to reduce the lignin content in cut stems, to improve the quality of cut stems and to increase their proportion in cigarette blends, single factor experiments were conducted to study the effects of four factors involved in synthesis of Fe-CA biomimetic (molar ratio, reaction temperature, reaction time, and pH). The synthesis process of Fe-CA biomimetic was optimized by orthogonal test, the cut stems were analyzed by scanning electron microscope before and after Fe-CA biomimetic treatment, and the sensory quality of cigarettes made of the treated and untreated cut stems was panel tested, separately. The results showed that: under the optimum synthesis conditions,n(Fe2+):n(citric acid) 11, reaction temperature 60 ℃, reaction time 40 min, and pH 6.0, the synthesis rate is 82.1%; after the Fe-CA biomimetic treatment of the cut stems , the content of lignin in cut stems fell from 3.49% to 1.60%, the removal rate reached 54.15%, and the surface of the cut stems was smoother with less burrs; compared with the control, the aroma quality, aroma quantity of the test cigarette smoke were improved, the levels of offensive odor and irritation were reduced, and the quality of the cut stems was enhanced.

cut stem; biomimetic; lignin; cigarette; sensory evaluation

S 572

：A

2016-10-21

河南农业大学重点学科基金项目(30600980)

赵士举(1979-)，男，河南荥阳人，副教授，主要从事功能化研究。

于建军(1957-)，男，山东文登人，教授。

1000-2340(2017)02-0212-06