姜黄素通过调节组织蛋白酶K改善高脂诱导C57BL/6J小鼠骨结构和骨质量的实验研究

马如风，王丽丽，左加成，朱如愿，刘海霞，柳辰玥，李 琳，陈贝贝，赵丹丹，莫芳芳，牛建昭，高思华，张东伟

(北京中医药大学 1. 中医学院, 2. 中药学院, 3. 糖尿病研究中心，北京 100029)

姜黄素通过调节组织蛋白酶K改善高脂诱导C57BL/6J小鼠骨结构和骨质量的实验研究

马如风1，王丽丽1，左加成1，朱如愿1，刘海霞1，柳辰玥2，李 琳1，陈贝贝1，赵丹丹3，莫芳芳3，牛建昭1，高思华3，张东伟3

(北京中医药大学 1. 中医学院, 2. 中药学院, 3. 糖尿病研究中心，北京 100029)

目的探讨姜黄素对高脂诱导的C57BL/6J小鼠骨结构和骨质量的影响及其与组织蛋白酶K(cathepsin K)表达的相关性。方法用姜黄素(50 mg·kg-1)干预高脂饲料诱导的C57BL/6J小鼠骨质疏松模型12周后，取小鼠股骨和胫骨，分别用HE染色、茜素红染色和番红O /固绿染色观察骨组织微结构变化、骨代谢以及骨发育情况；用免疫组化法和Western blot法检测小鼠骨组织中组织蛋白酶K蛋白的表达。结果病理形态学结果显示，姜黄素能明显改善高脂诱导的C57BL/6J小鼠的骨组织微结构，促进软骨发育和改善骨钙化程度；骨生物力学结果表明，姜黄素能明显提高高脂诱导C57BL/6J小鼠的骨强度；免疫组化和Western blot检测结果显示，姜黄素能够明显抑制小鼠骨组织中的组织蛋白酶K表达。结论姜黄素能提高高脂诱导C57BL/6J小鼠的骨强度，改善骨微结构，其发挥骨保护作用机制之一可能与抑制组织蛋白酶K的表达相关。

姜黄素；骨微结构；骨生物力学；骨钙化；组织蛋白酶K；C57BL/6J小鼠

糖尿病性骨质疏松(diabetic osteoporosis, DOP)是一种由糖尿病诱发的慢性骨代谢疾病，临床研究表明，1/2～2/3的糖尿病患者伴有骨强度的下降，其中有近1/3的患者可诊断为骨质疏松[1]。糖尿病诱发骨代谢紊乱，使骨骼变脆而缺少韧性，尤其是在发病后期稍遇外力则易发生骨折[2-3]。DOP的发病机制涉及到破骨细胞活性增强、成骨细胞活性减弱、骨微循环异常、氧化应激以及晚期糖基化终末产物增加等因素[2,4-5]。有研究证明，糖尿病大鼠[6]和糖尿病绝经期妇女[7]骨组织中组织蛋白酶K的表达水平明显升高，从而促进破骨细胞的活化和骨吸收增强。因此，组织蛋白酶K在DOP的发生和发展过程中有重要的作用。

姜黄首载于唐代《新修本草》中，具有行气活血、通经止痛、祛风痹痛等功效。姜黄素(Curcumin)是从姜科姜黄属植物姜黄、郁金、莪术等根茎中提取的一种酚类化合物，是中药郁金、姜黄的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、防治糖尿病[8]及其并发症[9-10]的作用。本实验室和其他实验室的前期研究结果均表明，姜黄素能降低2型糖尿病模型动物的血糖水平，改善胰岛素抵抗[11-13]，但是姜黄素是否具有改善DOP的作用目前还未知。因此，为了探索姜黄素对DOP的作用和可能的作用机制，本研究拟以高脂饲料诱导C57BL/6J模型为基础，观察姜黄素治疗12周后，小鼠骨组织的病理变化和生物力学变化，以及其对骨质疏松关键酶组织蛋白酶K的调节作用。1材料

1.1仪器莱卡石蜡切片机(德国)；Olympus BX53倒置荧光显微镜(日本)；博勒飞质构仪CT3(美国)；Azure c300化学发光成像系统(美国)。

1.2试剂与药物姜黄素(上海升华医药科技有限公司)；ECL超敏发光液(北京普利莱基因技术有限公司)；盐酸吡格列酮片(pioglitazone，北京太平洋药业有限公司，批号：140908，规格：15 mg/片)；茜素红、番红O、固绿(Sigma-Aldrich，美国)；Cathepsin K抗体(H-130，sc28867, Santa Cruz)。

1.3动物♂ SPF级C57BL/6J小鼠，平均体质量20 g，购自斯贝福(北京)实验动物科技有限公司，许可证号SCXK(京)2011-0004。饲养于北京中医药大学科研实验中心清洁级动物实验室，合格证号SCXK(京)2011-0024，室温22℃，相对湿度(55±5)%，光暗周期12 h/12 h。实验期间小鼠给予自由饮水。2方法

2.1高脂动物模型的构建将C57BL/6J ♂小鼠用高脂饲料(20%蔗糖、2.5%胆固醇、10%猪油、1%胆酸钠、66.5%基础饲料，购于北京华阜康生物科技股份有限公司)喂养1个月后，选取血糖≥11.1 mmol·L-1的小鼠30只，随机等分为模型组(Model group)、阳性药吡格列酮组(pioglitazone group)和姜黄素组(curcumin group)，同时设正常组(Normal group)小鼠10只，普通饲料喂养。实验时，正常组和模型组小鼠给予去离子水灌胃，阳性药组小鼠给予吡格列酮(10 mg·kg-1)，姜黄素组小鼠给予姜黄素(50 mg·kg-1)，连续给药12周。除正常组外，其余各组小鼠均给予高脂饲料喂养。

2.2取材及样品制备12周后，小鼠用1%戊巴比妥(0.04 mL·kg-1)腹腔麻醉处死。然后分离两侧股骨和胫骨，剥离附着的肌肉组织。将右侧股骨、胫骨用生理盐水浸湿的纱布包被，置-80℃备用，左侧股骨先置于10%中性福尔马林中固定72 h后，用15% EDTA钠(pH 7.4)溶液脱钙，脱钙液每2周更换1次，连续脱钙3个月后冲水，包埋，切片备用。

2.3骨生物力学的测定用质构仪对各组小鼠股骨进行三点弯曲实验。将小鼠股骨置于跨距为7 mm的2个支撑点上，标本的宽面朝上水平放置，使探头以10 mm·min-1的速度缓慢下降，标本断裂后继续运行2 mm停止。根据探头下降的距离与载荷，结合骨断端直径，计算出第一循环硬度、硬度形变量、峰值压力等骨生物力学参数。

2.4骨组织HE染色将股骨石蜡切片(5 μm)常规HE染色，透明，封片，显微镜下观察病理变化并拍照。

2.5茜素红染色(AlizarinRedSStain) 按郭鱼波等[14]描述的实验方法，将股骨石蜡切片常规脱蜡；茜素红染色2 min；用丙酮和丙酮-二甲苯混合液分别分色20 s；透明，封片，显微镜下观察并拍照。用Image Pro Plus 6.0图像分析软件分析Alizarin Red S Stain的相对IOD值。

2.6番红O/固绿染色(SafraninO/FastGreenStain) 将股骨石蜡切片常规脱蜡，苏木精染色5 min，自来水冲洗3 min，1% HCl-乙醇分化2 s，去离子水洗3次，0.05% Fast Green染色5 min后，用1%醋酸洗30 s，0.1% Safrain O染色5 min后，95%乙醇洗3次，100%乙醇洗2次，透明，封片，显微镜下观察，拍照。用Image Pro Plus 6.0图像分析软件分析Safranin O/Fast Green Stain的相对IOD值。

Fig 1 HE staining of femoral metaphysis in mice(×100)

A:Normal;B:Model;C:Pioglitazone;D:Curcumin

Fig 2 Alizarin red S staining offemoral metaphysis in mice(±s,n=7)

Alizarin red S staining(A×100) and its analysis(B). 1:Normal;2:Model;3:Pioglitazone;4:Curcumin.#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsmodel group

2.7免疫组织化学染色参照Guo等[15]描述的实验方法，将股骨石蜡切片常规脱蜡，骨组织抗原修复液(上海舜百生物科技有限公司)进行抗原修复后，用3% H2O2室温孵育30 min，然后用10%山羊血清封闭30 min，滴加1 ∶200稀释的Cathepsin K抗体，4℃孵育过夜，然后滴加辣根酶标记的二抗工作液，室温孵育30 min，DAB显色，苏木精复染后常规脱水、透明、封片，显微镜下观察，拍照。用Image Pro Plus 6.0分析软件进行图像分析，测定阳性细胞的平均吸光度(A)。

2.8Westernblot参照Guo等[15]描述的实验方法，用RIPA裂解液提取在液氮里研碎的骨组织蛋白后，取80 μg蛋白溶液，加到12%的SDS-PAGE电泳胶电泳分离，然后转印至PVDF膜，分别将膜与Cathepsin K(1 ∶500)和β-actin(1 ∶1 000)抗体4℃孵育过夜。次日，将膜与相应的二抗室温共孵育1 h，然后用ECL超敏发光液显色，Azure c300化学发光成像系统拍照，并用Image Pro Plus 6.0图像分析软件进行半定量灰度值分析。

Fig 3 Safrain O/Fast Green stainingof femoral epiphysis in mice(±s,n=7)

Safranin O/fast green staining(A×100) and its analysis(B). 1:Normal; 2:Model; 3:Pioglitazone; 4:Curcumin.#P<0.05vsnormal group；*P<0.05vsmodel group

Fig 4 Femur bone biomechanics in mice(±s,n=7)

Three-point bending examination results of the hardness variable(A), first cycle hardness(B) and peak pressure(C).#P<0.05vsnormal group；*P<0.05vsmodel group.

3 结果

3.1姜黄素对高脂喂养小鼠股骨病理形态学的影响实验小鼠的股骨组织切片HE染色结果如Fig 1所示。光镜(×100)下观察发现，正常小鼠股骨干骺端镜下骨小梁呈网状，排列整齐，骨微结构完整。与正常组小鼠相比，模型组小鼠股骨干骺端脂滴增多，骨小梁结构紊乱、变细、断裂。与模型组小鼠相比，阳性药组和姜黄素组小鼠的骨小梁排列相对整齐，骨微结构形态明显改善，脂滴明显减少，骨小梁增粗排列较规则，但与正常组小鼠相比，姜黄素组小鼠骨组织结构仍然未恢复到正常状态。

3.2姜黄素对高脂喂养小鼠股骨组织钙化的影响在成骨细胞分化过程中，钙离子与茜素红反应后，沉积形成钙结节。钙结节数量反映了成骨细胞的活化程度和骨形成速度。茜素红染色(Fig 2A)和图像分析结果(Fig 2B)显示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠股骨成骨细胞钙化结节数量减少(P<0.05)；与模型组小鼠相比，阳性药组和姜黄素组小鼠的钙结节和数量明显增加，分布也相对比较均匀(P<0.05)。3.3姜黄素对高脂喂养小鼠软骨组织修复的影响骨组织软骨中的糖胺聚糖可以被番红O染成红色，钙化骨则可以被固绿染成绿色。如Fig 3A的Safrain O/Fast Green染色所示，光镜下观察发现，模型组小鼠可见到形态不均匀的红色，正常组、阳性药组、姜黄素组小鼠可见到形态相对均匀的红色。图像分析结果(Fig 3B)表明，同正常组小鼠相比，模型组小鼠股骨的糖胺聚糖含量明显减少(P<0.05)。同模型组小鼠相比，给予姜黄素和吡格列酮连续治疗12周后，高脂饮食小鼠股骨干骺端的糖胺聚糖含量明显增加(P<0.05)，分布也相对比较均匀。

3.4姜黄素对高脂喂养小鼠股骨生物力学的影响各组小鼠股骨生物力学检测结果见Fig 4。与正常组小鼠相比，模型组小鼠股骨的硬度形变量、第一循环硬度和峰值压力均明显降低(P<0.05)。与模型组小鼠相比，经吡格列酮和姜黄素治疗12周后的高脂饮食小鼠股骨硬度形变量、第一循环硬度和峰值压力均升高(P<0.05)。

Fig 5 Effect of curcumin on expression of cathepsin K in mouse bone tissues

A, B: Immunohistochemical staining and the analyses of cathepsin K level in the femurs of mice. a1, a2: Normal; b1, b2: Model; c1, c2: Pioglitazone; d1, d2: Curcumin. C: Western blot images and the analyses of cathepsin K level in the tibias of mice.#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsmodel group

3.5姜黄素对高脂喂养小鼠骨组织中组织蛋白酶K表达的影响如Fig 5所示，与正常组小鼠相比，模型组小鼠骨组织中的组织蛋白酶K的表达明显升高(P<0.05)；与模型组小鼠相比，经姜黄素和吡格列酮治疗12周后的高脂饮食小鼠组织蛋白酶K的表达明显降低(P<0.05)，且免疫组化法和Western blot的检测结果一致。

4 讨论

糖尿病患者糖脂代谢异常，可通过不同的途径影响骨代谢，从而导致DOP的发生。现代医学认为1型糖尿病可以导致骨质疏松[16]，2型糖尿病发病机制复杂[17]，糖尿病病程、性别、年龄、体质量指数、糖尿病合并症及部分治疗糖尿病的药物等因素，均可导致骨基质转换下降、钙盐丢失、骨脆性增加、骨微结构退变，由此诱发骨质量下降及骨折的发生率明显增高，进而诱发骨质疏松[18]。

近年来，具有胶原酶活性的组织蛋白酶K越来越受到关注。组织蛋白酶K参与多种疾病的发病过程中，且与骨质疏松的关系最为密切，是破骨细胞中目前发现的最主要、表达水平最高、溶骨活性最强的细胞因子，参与细胞外基质的降解[19]。在骨降解中，活化的破骨细胞能分泌酸性物质溶解骨表面的矿物质，同时骨胶原或骨基质也被破骨细胞分泌的组织蛋白酶K降解。研究表明，破骨细胞中组织蛋白酶K的胶原蛋白酶活性过高是导致骨和软骨组织等处骨基质和骨软骨胶原蛋白的过度降解，进而诱发骨质疏松的主要原因[20]。

国内外大量研究证实，姜黄素能明显地改善胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱，能在一定程度上预防和治疗2型糖尿病及其慢性并发症。Arun等[12]和Mahesh等[13]研究表明，姜黄素能明显降低糖尿病模型大鼠的血糖水平。Suryanarayana等[21]研究发现，姜黄素可以延缓由链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病大鼠白内障的进展及成熟。体外研究发现，姜黄素可通过刺激破骨细胞的凋亡，抑制骨吸收[22]，还可以抑制破骨细胞的形成和分化[23]。本实验室的前期研究[15]也发现，组织蛋白酶K的过度表达与糖尿病小鼠骨质的恶化关系密切。本实验的结果也表明，姜黄素连续治疗12周后，可以明显改善高脂喂养小鼠的骨微结构，促进骨钙化和软骨的发育；提高小鼠股骨的第一循环硬度、硬度形变量，峰值压力，增强骨生物力学性能。免疫组化法和Western blot研究结果表明，姜黄素能够明显抑制股骨和胫骨组织中Cathespin K的蛋白表达水平，进而保护高脂诱发的骨质恶化，以上结果同研究报道相一致。

综上所述，本实验研究证明，姜黄素能改善高脂喂养的C57BL/6J小鼠的骨微结构、骨钙沉积水平和骨生物力学性能，其作用机制可能是通过调节诱发骨质疏松的关键因子组织蛋白酶K，进而发挥改善高脂饮食小鼠骨代谢作用的。

(致谢：本文实验在北京中医药大学逸夫科研楼高思华团队实验室完成，在此对指导老师和实验参与人员表示感谢！)

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Anexperimentalstudyofeffectofcurcuminonimprovementofbonemicroarchitectureandbonequalityinhigh-fat-dietC57BL/6JmiceanditsassociationwithcathepsinK

MA Ru-feng1, WANG Li-li1, ZUO Jia-cheng1, ZHU Ru-yuan1, LIU Hai-xia1, LIU Chen-yue2, LI Lin1,CHEN Bei-bei1, ZHAO Dan-dan3, MO Fang-fang3, NIU Jian-zhao1, GAO Si-hua3, ZHANG Dong-wei3

(1.PreclinicalMedicineSchool,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;2.CollegeofTraditionalChineseMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China;3.DiabetesResearchCenter,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

AimTo investigate the effect of curcumin against high-fat-diet induced C57BL/6J mice bone changes and the correlation between the expression of cathepsin K and curcumin.MethodsCurcumin treated C57BL/6J mice had been on high fat diet for 12 weeks. The HE, Alizarin red S staining and Safranin O/fast green staining of femur were employed to evaluate bone microstructure, bone metabolism and bone development. The expressions of cathepsin K were assessed by Western blot and immunohistochemical staining.ResultsHistopathological results showed that curcumin could improve the destruction of trabecular bone structure, cartilage development and bone calcification. Biomechanical results proved that curcumin could improve the bone strength of the type 2 diabetic mice induced by high fat. The results of immunohistochemistry and Western blot assay indicated that curcumin could significantly inhibit the expression of cathepsin K in bone tissues of mice.ConclusionCurcumin can increase bone strength, improve bone microstructure, and enhance the degree of bone calcification, which may be achieved by inhibiting the expression of cathepsin K.

curcumin; bone microarchitecture; bone mechanical strength; bone calcification: cathepsin K; C57BL/6J diabetic mice

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.023

A

：1001-1978(2017)10-1446-06

R-332；R282.71；R336；；R587.2；R681.01；R977.3

时间：2017-9-5 9:26 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.046.html

2017-05-20,

2017-08-15

国家自然科学基金资助项目(No 81273995，81274140)；国家科技部“重大新药创制”科技重大专项(No 20122X09103201)；高等学校学科创新引智计划资助项目(No B07007)；北京市自然科学基金资助项目(No 7172126)

马如风(1988-)，男，硕士生，研究方向：代谢性疾病的发病机制，E-mail：marufeng5188@126.com； 张东伟(1974-)，男，博士，副研究员，研究方向：中药活性成分的筛选和作用机制，通讯作者，Tel：010-64286915，E-mail：zhdw1006@163.com