Rho激酶在远距缺血后处理抗心肌缺血/再灌注损伤中的作用

闵 凤，贾贤杰，时红杰，胡 静，胡志远，高 琴，于 影

(蚌埠医学院1. 公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室、2. 科研中心、3. 生理学教研室，安徽 蚌埠 233030)

Rho激酶在远距缺血后处理抗心肌缺血/再灌注损伤中的作用

闵 凤1,2，贾贤杰1，时红杰1，胡 静2，胡志远2，高 琴3，于 影3

(蚌埠医学院1. 公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室、2. 科研中心、3. 生理学教研室，安徽 蚌埠 233030)

Rho激酶；远距缺血后处理；缺血/再灌注损伤；心肌保护；法舒地尔；溶血磷脂酸

心血管疾病是全球性的重大公共卫生问题，在我国心血管疾病一直处于上升趋势，超过30%的心血管疾病患者死因是缺血性心脏病，严重影响人类健康[1]。及时恢复血流是减少心肌缺血损伤的最有效方法，然而心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)时引起氧自由基生成增加、炎症反应、线粒体损伤、细胞凋亡等，导致心肌组织永久性或致死性的损伤[2]。研究显示[3]，再灌注前给予一些预处理能够明显降低心肌I/R损伤。远距缺血后处理(remote ischemic postconditioning，RIPostC)是在缺血心肌再灌注前，对远离心脏的组织器官给予短暂的I/R干预，可减轻较长时间的再灌注损伤[4]。因此，RIPostC的心肌保护作用及其相关机制值得我们深入研究。

近年研究发现，Rho激酶信号通路参与了心肌I/R损伤等心血管疾病，Rho激酶通过介导下游肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)的磷酸化，引起冠状动脉痉挛加重心肌损伤[5]。给予Rho激酶阻断剂法舒地尔(fasudil，Fas)可能通过诱导自噬的发生，减少心肌梗死面积，降低心肌细胞凋亡，减轻I/R损伤[6-7]。那么，远距缺血后处理的心肌保护作用是否也与抑制Rho激酶有关，尚未见报道。本研究通过复制在体大鼠远距缺血后处理模型，观察在激动或阻断Rho激酶作用下对远距缺血后处理心肌保护作用的影响，探讨Rho激酶信号通路在远距缺血后处理中的作用及其相应的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 30只SPF级SD大鼠，♂，体质量(300±50)g，由蚌埠医学院实验动物中心提供，实验动物许可证编号：SCXK(沪)2013-0006。

1.1.2药品与试剂 盐酸法舒地尔，天津红日药业股份有限公司；溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)，美国Sigma公司；肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脱氢酶(actate dehydrogenase，LDH)试剂盒，南京建成生物工程研究所；鼠抗磷酸化肌球蛋白轻链(phospho-myosin light chain，p-MLC)、兔抗GAPDH，美国Cell Signaling Technology 公司；羊抗小鼠、羊抗兔抗体，武汉博士德生物工程有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、QuickBlockTMWestern封闭液，上海碧云天生物技术研究所；ECL发光液，美国Millipore公司。

1.1.3仪器 动物呼吸机，ALC-V9型，上海奥尔科特生物科技有限公司；生物信号采集处理系统，MedLab-U/4C501H，南京美易科技有限公司；酶标仪，BioTek-Epoch，美国伯腾仪器有限公司；电泳仪，Bio-Rad，美国伯乐公司；冷冻高速离心机，Eppendor-5810R，德国艾本德股份公司。

1.2方法

1.2.1模型制备 4%水合氯醛(10 mL·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉完全后，将大鼠仰卧位固定于手术台上，连接MedLab生物信号采集处理系统，记录Ⅱ导联心电图，进行气管插管连接呼吸机，呼吸频率为70～80 times·min-1，潮气量为20～30 mL·kg-1。分离右侧颈总动脉，与压力换能器相连，记录全程动脉血压。大鼠开胸暴露心脏后，用无创伤缝合线在肺动脉圆锥与左心耳之间的LAD中上1/3处的心肌表层下方穿过，用聚四氟乙烯管穿过线的两端，拉紧线造成缺血，心电图ST段抬高表示缺血成功。缺血45 min后松开线，冠状动脉再灌注180 min，完成心肌I/R损伤模型。

1.2.2实验分组 30只♂SD大鼠随机分成5组：① 假手术组(Sham)：开胸，冠状动脉左前降支(left anterior descending，LAD)穿线不结扎，持续225 min。② 缺血/再灌注组(I/R)：LAD缺血45 min，再灌注180 min。③ 远距缺血后处理组(RIPostC)，参考本实验室前期研究的模型制备方法[8-9]，手术操作同I/R组，在LAD缺血15 min后，结扎大鼠一侧股动脉使其缺血5 min+再灌注5 min，给予3次循环。④ 缺血/再灌注+Fas组(I/R+Fas)，同I/R组，并于再灌注前5 min静脉注射Rho激酶阻断剂Fas(10 mg·kg-1)。⑤ 远距缺血后处理+LPA组(RIPostC+LPA)：同RIPostC组，但在再灌注前5 min静脉注射Rho激酶激动剂LPA(每只1mg)[10]。

1.2.3血流动力学指标和心电图观测指标测定 MedLab生物信号采集处理系统在大鼠颈总动脉插管后全程记录平均动脉压(mean arterial blood pressure，MAP)和心率(heart rate，HR)的变化。Ⅱ导联心电图全程监测，并计算各实验组在Baseline、缺血45 min、复灌30、60、120、180 min时心电图ST段抬高幅度。

1.2.4血浆CK、LDH的活性变化水平 于再灌注180 min，用一次性肝素钠采血管取腹主静脉血，以3 000 r·min-1离心15 min，留取上清液置于-80℃冻存备用。严格按照CK试剂盒和LDH试剂盒说明书，分别在波长660 nm和440 nm，光径1 cm，测定各管吸光度值，根据公式得出血浆CK和LDH活性。1.2.5HE染色病理组织形态学观察 实验结束后留取左室前壁心肌组织，用生理盐水冲去血污，在心脏结扎线以下留取100 mg心脏组织(切成4 mm厚的心肌片)，放入4%的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜观察。

1.2.6心肌梗死面积测定 再灌注180 min后立即取出心脏，用PBS冲洗2～3次后结扎冠脉，将1% Evans blue从主动脉处注入心脏，于-80℃冷冻后，沿着左心室横切面切成2 mm厚的均匀薄片，放置在1%氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazoliume chloride，TTC)溶液中，37℃恒温避光染色20 min，4%的多聚甲醛溶液中固定30 min。灰白色区域为梗死区(percentage infarct size，IS)，砖红色区域为危险区(area at risk，AAR)。采用Image J图像分析软件，计算心肌梗死面积/%=IS/AAR×100%[11]。

1.2.7Western blot检测p-MLC蛋白表达水平 实验结束后，留取大鼠缺血区域心肌组织100 mg，加入1 mL含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，冰上研磨，离心后取上清液，BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。取上样量40 μg，SDS-PAGE凝胶电泳分离。电泳条件：浓缩胶恒压60 V，约30 min；分离胶恒压90 V，约90 min。转膜：恒流200 mA，约2 h。QuickBlockTM封闭液室温封闭2 h，小鼠抗大鼠多克隆抗体(p-MLC 1 ∶2 000)、兔抗大鼠多克隆抗体(GAPDH 1 ∶3 000)37℃孵育30 min，60 r·min-1摇床30 min，4℃过夜；羊抗小鼠IgG(1 ∶4 000)、羊抗兔IgG(1 ∶8 000)37℃孵育20 min，100 r·min-1室温摇床40 min；TBST洗膜4次，前3次每次10 min，最后1次5 min；ECL显影，用Image J软件对目的条带进行灰度值分析，结果以目的条带和内参的比值表示。

2 结果

2.1血流动力学指标5组大鼠MAP、HR基础值差异均无统计学意义。与Sham组相比，其余各组在缺血期和再灌注期MAP、HR均降低，除复灌180 min外，其余各时间段差异均有统计学意义(P<0.05)。与I/R组相比，RIPostC组MAP升高，且再灌注30、60 min时差异具有统计学意义(P<0.05)，IR+Fas组MAP升高，且再灌注30、60、120 min差异具有统计学意义(P<0.05)。与RIPostC组相比，RIPostC+LPA组MAP、HR在缺血45 min时明显降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)。见Fig 1。

2.2心电图ST段变化与Sham组相比，其余各组大鼠在缺血45 min及复灌30、60、120 min、I/R组180 min时心电图ST段抬高幅度明显增加，且差异具有统计学意义(P<0.05)。与I/R相比，RIPostC组、I/R+Fas组心电图ST段幅度降低，且在缺血45 min、复灌30、60、120 min时差异具有统计学意义(P<0.05)。与RIPostC相比，RIPostC+LPA组ST段幅度增加，且在缺血45 min、复灌30、60、120 min时差异具有统计学意义(P<0.05)。见Fig 2。

Fig 1 Hemodynamic data in rats(±s，n=6)

A:Changes of MAP in different groups;B:Changes of HR in different groups.I45:Ischemia 45 min;R30:Reperfusion 30 min;R60:Reperfusion 60 min;R120:Reperfusion 120 min;R180:Reperfusion 180 min.*P<0.05vssham；#P<0.05vsI/R；△P<0.05vsRIPostC

Fig 2 Changes of △ST electrocardiogram(±s，n=6)

I45:Ischemia 45 min;R30:Reperfusion 30 min; R60: Reperfusion 60min; R120: Reperfusion 120 min ; R180: Reperfusion 180 min.*P<0.05vssham；#P<0.05vsI/R；△P<0.05vsRIPostC

2.3血浆CK和LDH的变化与Sham组相比，I/R组、RIPostC+LPA组CK、LDH活性升高，且差异具有统计学意义(P<0.05)；与I/R组相比，RIPostC组、I/R+Fas组CK、LDH活性明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与RIPostC组相比，RIPostC+LPA组CK、LDH活性明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。见Fig 3、4。

Fig 3 Effect of remote ischemia postconditiong andRho-kinase on plasma activities of CK in rats(±s，n=6)

*P<0.05vssham；#P<0.05vsI/R；△P<0.05vsRIPostC

Fig 4 Effect of remote ischemia postconditiong andRho-kinase on plasma activities of LDH in rats(±s，n=6)

*P<0.05vssham；#P<0.05vsI/R；△P<0.05vsRIPostC

2.4心脏组织形态学变化HE染色显示(Fig 5)， Sham组大鼠心肌纤维排列规则，结构清晰，炎性细胞浸润较少，细胞形态学表现基本正常；IR组心肌纤维断裂，排列不规则，大量心肌细胞变性、水肿、炎性细胞浸润。与I/R组相比，RIPostC和I/R+Fas组心肌纤维排列基本规则，炎性细胞浸润也明显减轻。与RIPostC组相比，RIPostC+LPA组心肌纤维明显增粗，排列紊乱、部分心肌细胞水肿。

2.5心肌梗死面积变化与I/R组相比，RIPostC与I/R+Fas组心肌梗死面积明显减小(P<0.05)，与RIPostC组相比，RIPostC+LPA组心肌梗死面积明显增加(P<0.05)。结果显示，RIPostC和使用Rho激酶抑制剂能明显降低大鼠I/R后的心肌梗死面积，而使用Rho激酶激动剂则心肌梗死面积增加。见Fig 6。

2.6大鼠心肌组织p-MLC蛋白表达与Sham组相比，I/R组、RIPostC+LPA组p-MLC活性明显增加(P<0.05)；与I/R组相比，RIPostC组、I/R+Fas组p-MLC活性明显降低(P<0.05)；与RIPostC组相比，RIPostC+LPA组p-MLC活性明显增加(P<0.05)。见Fig 7。

3 讨论

Rho激酶是分子质量为160 ku的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与变异性心绞痛、心力衰竭、心肌I/R损伤等疾病的发生[12]。大量研究表明[13]，Rho激酶在I/R损伤中扮演重要角色，抑制Rho激酶能够改善缺血心肌的能量代谢，抑制炎症反应和细胞凋亡等作用。激活Rho激酶，可通过抑制肌球蛋白活性，引起胞质内MLC磷酸化，增加平滑肌细胞Ca2+的敏感性，导致平滑肌收缩冠状动脉痉挛，加重心肌损害[5,12]。本实验结果显示，与Sham组相比，I/R组p-MLC表达明显增高，说明I/R损伤明显增强Rho激酶的活性。与I/R组比较，使用Rho激酶抑制剂Fas后，p-MLC表达水平明显降低。在RIPostC组中，我们也同样观察到p-MLC表达水平明显降低，说明远距缺血后处理具有类似法舒地尔的作用，抑制Rho激酶活性；而与RIPostC相比，在RIPostC心肌I/R损伤时，可引起氧自由基生成增加、钙超载、炎症反应、线粒体损伤、膜通透性增加，心肌酶大量漏出，细胞凋亡等，使冠状动脉功能障碍，加重心肌细胞损伤[4,11]。CK和LDH是目前较常用的心肌酶检测指标，CK、LDH的少量漏出提示细胞膜的通透性增高，漏出情况反映出细胞膜的受损程度。此外，CK、LDH从心肌组织到血液的漏出也是急性心肌梗死的标志，临床上早期血液中CK、LDH升高，可作为诊断急性心肌梗死的标准之一[7,14]。实验结果显示，与Sham组相比，I/R组血浆中CK、LDH活性明显增加，心肌损伤加重。与I/R组相比，RIPostC组、I/R+Fas组CK、LDH活性明显降低，心肌损伤有所改善，提示远距缺血后处理和使用Rho激酶的抑制剂法舒地尔都能够减轻I/R导致的心肌细胞损伤。而与RIPostC组相比，RIPostC+LPA组CK、LDH活性明显增加，说明Rho激酶活性增强，可降低远距缺血后处理的心肌保护作用。

本实验同时还观察各组大鼠血流动力学指标、心肌组织HE染色及梗死面积的改变。结果显示，与I/R相比，RIPostC组、I/R+Fas组血流动力学MAP、HR增高和心电图ST段降低，心肌组织病理形态有明显改善，心肌纤维排列较整齐，炎性细胞浸润减轻，心肌梗死面积减少。而给予Rho激酶激动剂LPA减弱了RIPostC的保护作用，进一步说明远距缺血后处理的保护作用可能与降低Rho激酶的活性有关。

Fig 5 HE staining of cardiomyocytes in each group

A:Sham;B:I/R;C:RIPostC;D:I/R+Fas;E:RIPostC+LPA

Fig 6 Effects of remote ischemic postconditioning,Fas and LPA on infarct size(±s，n=6)

*P<0.05vssham；#P<0.05vsI/R；△P<0.05vsRIPostC

Fig 7 Expression of p-MLC protein in myocardiumof rats in each group(±s，n=6)

A:Representative Western blot; B: Quantitative analysis of the p-MLC/GAPDH protein expression ratios in the myocardium of the rats.*P<0.05vssham；#P<0.05vsI/R；△P<0.05vsRIPostC

组中使用Rho激酶激动剂LPA后，p-MLC的表达量明显增高，Rho激酶的活性增强，进一步提示远距缺血后处理的心肌保护作用与Rho激酶的信号通路有关。

综上所述，Rho激酶信号通路可能参与了远距缺血后处理抗大鼠心肌I/R损伤的作用，远距缺血后处理通过抑制Rho激酶的活性减轻心肌细胞的损伤，发挥抗心肌I/R损伤作用。当然，Rho激酶在远距缺血后处理的确切机制，仍有待于我们进一步深入研究，以期为其今后应用于临床提供重要的理论依据。

(致谢：本实验在蚌埠医学院科研中心心脑血管实验室完成，在此特别感谢参与本实验的所有老师和同学。)

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RoleofRho-kinaseinremoteischemicpostconditioningagainstmyocardialischemia/reperfusioninjury

MIN Feng1,2, JIA Xian-jie1, SHI Hong-jie1, HU Jing2, HU Zhi-yuan2,GAO Qin3, YU Ying3

(1.DeptofEpidemiologyandStatistics;2.ResearchCenter;3.DeptofPhysiology,BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233030,China)

AimTo explore the role of Rho-kinase in remote ischemic postcondi-tioning and its possible mechanism.MethodsThirty male Sprague-Dawley rats were divided into five groups(n=6): sham group(Sham), ischemia/reperfusion group(I/R), remote ischemic postconditioning group(RIPostC), I/R with Rho-kinase inhibitor fasudil group(I/R+Fas) and RIPostC with Rho-kinase activator lysophosphatidic acid group(RIPostC+LPA). Throughout the whole process of experiment, mean arterial pressure(MAP), heart rate(HR) and Ⅱ lead electrocardiogram were continuously monitored. At the end of the reperfusion, plasma creatine kinase(CK) and lactate dehydrogenase(LDH) were measured. Myocardial histopathologic changes were observed by hematoxylin and eosin(HE) staining. Infarct size was measured using 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC) staining. The expressions of phospho-myosin light chain(p-MLC) were detected with Western blot analysis.ResultsCompared with Sham group, the MAP and HR of other groups decreased, while the amplitude of ST segment increased. Compared with I/R group, MAP and HR increased, the amplitude of ST segment decreased, plasma CK and LDH activity decreased, myocardial pathological morphology and infarct size were improved significantly, infiltration of inflammatory cells was reduced, and the expression of p-MLC decreased in RIPostC and I/R+Fas group. Compared with RIPostC group, RIPostC+LPA group attenuated the effects of RIPostC, and the recovery of the above indicators were inhibited.ConclusionRho-kinase signaling pathway might mediate remote ischemia postconditioning against myocardial ischemia/reperfusion injury.

Rho-kinase; remote ischemic postconditioning; ischemia/reperfusion; cardioprotection; fasudil; lysophosphatidic acid

:目的探讨Rho激酶在远距缺血后处理(remote ischemic postconditioning, RIPostC)中的作用及其可能的作用机制。方法30只♂SD大鼠随机分为假手术组(Sham)、缺血/再灌注组(I/R)、远距缺血后处理组(RIPostC)、缺血/再灌注+Rho激酶阻断剂法舒地尔组(I/R+Fas)，远距缺血后处理+Rho激酶激动剂溶血磷脂酸组(RIPostC+LPA)，每组6只。全程监测动脉血压和Ⅱ导联心电图，实验结束后测定血浆肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)活性变化，HE染色观察心肌组织形态学变化，TTC染色法评价心肌梗死面积，Western blot测定磷酸化肌球蛋白轻链(p-MLC)蛋白表达。结果与Sham组相比，其余各组MAP、HR均下降，ST段增高；与I/R组相比，RIPostC和I/R+Fas组MAP、HR升高，ST段降低，心肌组织病理形态有明显改善，炎性细胞浸润减轻，心肌梗死面积降低，CK、LDH释放减少，p-MLC表达降低；与RIPostC组相比，RIPostC+LPA组减弱了RIPostC的作用，抑制了上述指标的恢复。结论Rho激酶信号通路可能参与了远距缺血后处理抗心肌缺血/再灌注损伤的作用。

时间：2017-9-5 9:26 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.024.html

2017-04-22,

2017-08-24

安徽省自然科学基金青年项目(No 1508085QH150)；蚌埠医学院研究生创新计划项目(No Byycxz1632)；国家级大学生创新项目(No 201610367011)

闵 凤(1989-)，女，硕士生，研究方向：疾病预防与控制，E-mail:1790638214@qq.com； 于 影(1981-)，女，硕士，副教授，研究方向：心血管生理学，通讯作者，E-mail: yuying2011@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.012

A

：1001-1978(2017)10-1387-06

R-332；R322.11；R345.57；R364.12；R542.2；R977.3