激光共聚焦显微镜在牙本质粘接界面观察中的应用

周 唯，陈吉华

（军事口腔医学国家重点实验室，口腔疾病国家临床医学研究中心，陕西省口腔医学重点实验室，空军军医大学口腔医院修复科，陕西 西安 710032）

激光共聚焦显微镜在牙本质粘接界面观察中的应用

周 唯，陈吉华

（军事口腔医学国家重点实验室，口腔疾病国家临床医学研究中心，陕西省口腔医学重点实验室，空军军医大学口腔医院修复科，陕西 西安 710032）

先制备牙本质粘接试件，将切片打磨后使用激光共聚焦显微镜对牙本质粘接界面的自发荧光特征进行探测。不同粘接剂形成的粘接界面都表现出了特异性的自发荧光现象，不同结构区分明显。这种激光共聚焦显微镜探测自发荧光有可能成为一种新的牙本质粘接界面观察分析方法。

牙科粘接剂；牙本质粘接界面；自发荧光；激光共聚焦显微镜

牙科粘接技术和粘接修复材料在经过数十年的发展后，其短期修复效果大多良好，但长期稳定性不太理想，牙本质粘接耐久性的保持已成为制约牙科粘接修复效果提高的重要问题[1]。近年来，国内外都有大量的研究，并提出了很多新的粘接技术和粘接修复材料。值得注意的是，所有提高牙本质粘接耐久性措施的有效性确认都必须依赖于各种粘接性能检测手段，其中非常重要也是必不可少的一项就是牙本质粘接界面的观察分析。目前常用的粘接界面观察分析方法包括扫描电子显微镜、透射电子显微镜和显微拉曼光谱等[2～4]，然而这些方法都有缺点或局限。例如电镜技术，都有样本制作复杂、操作敏感性较高等缺点，并且样本的观察分析是一次性的，无法实现对同一样本粘接界面的变化进行动态监测。

自发荧光（Auto-fluorescence，AF）是物质受一定光线激发后，其本身发出的一种荧光现象[5]。有研究表明，牙体硬组织能够在一定激发光下产生自发荧光现象，并且在龋坏时牙本质和牙釉质的自发荧光信号会发生改变，这些均能够被激光共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM）观察到，因此，自发荧光可被用于对未发生组织崩解的早期龋的探测[6～8]。可见自发荧光能够被当作一种物质的特有属性，用于复合结构观察辨认的分析研究中。那么牙科粘接剂和牙本质粘接界面的各个结构是否也具有自发荧光、是否具备足够的特异性以用于对牙本质粘接界面的观察分析呢？本研究以检测牙本质粘接界面的自发荧光为特性，使用激光共聚焦显微镜探测自发荧光这种技术在牙本质粘接界面观察分析中的应用前景进行评估。

1 实验部分

1.1 实验材料

新鲜无龋的离体人第3磨牙（通过第四军医大学口腔医院伦理委员会批准，并与病人签署知情同意书）；全酸蚀粘接剂（Adaper™Single bond 2）、自酸蚀粘接剂（Adaper™Easy One）、37%磷酸凝胶（Scotchbond™Universal Etchant） 、 Z250复合树脂（Filtek™ Z250），美国3M ESPE公司；自酸蚀粘接剂（Clearfil™ SE Bond、Clearfil™S3 Bond），日本Kuraray Noritake Dental公司； 氰基丙烯酸胶（Zapit, Dental Ventures of America） ， 美国Anaheim Hills公司。

1.2 实验仪器

SYJ-150型慢速切割机，中国沈阳科晶公司；BioSonic UC50D型超声波清洗机，美国威尔登特公司；临床三用气枪、Spectrum ™800型光固化灯，美国登士柏公司；MATADOR型水砂纸，德国公司；FV1000型激光共聚焦显微镜，日本Olympus Corp.公司。

1.3 实验方法

1.3.1 牙本质粘接试件的分组制备

取新鲜无龋人的第3磨牙（拔除后30 d以内，保存在4 ℃生理盐水中），慢速切割机和金刚砂切割片在冷水下去除冠部釉质及牙根，制成2 mm厚的牙本质片。水砂纸按20 μm、10 μm、5 μm、3 μm、2 μm的次序进行逐级打磨，然后蒸馏水超声清洗5 min，以形成类似牙体预备后的牙本质玷污层。使用氰基丙烯酸胶将牙本质片固定在树脂平台上，连接水压装置并设置20 cm的水柱压力以模拟髓腔压力[9]。4种粘接剂的使用均按照说明书中的指导进行牙本质粘接，然后堆塑1 mm厚的Z250复合树脂并固化。

此外，还要对所有固化粘接剂本身的自发荧光进行观察，并设立了2组对照组，包括：①磷酸酸蚀不粘接组，使用37%磷酸凝胶处理牙本质15 s，不涂布粘接剂，然后堆塑复合树脂；②直接涂布粘接剂组，在预备好的牙本质片表面直接涂抹粘接剂Single Bond 2，固化后再堆塑复合树脂。

1.3.2 激光共聚焦显微镜观察

按照上述方法制备的牙本质粘接样本在37℃生理盐水中保存24 h，待材料完全聚合后，使用慢速切割机在水冷却下，沿垂直于粘接界面的方向将牙本质片切成厚度为0.5 mm的薄片，然后使用水砂纸打磨，用蒸馏水超声清洗10 min。为了预防牙本质样本在观察过程中发生因干燥脱水而导致的组织收缩，在进行激光共聚焦显微镜观察前，通过在湿润样本上滴加甘油来阻止水分蒸发[10]。制备好的样本置于盖玻片上，使用激光共聚焦显微镜在488 nm的激发波长及505 nm滤镜下对样本的自发荧光进行激发并观察[11，12]。在对粘接剂本身自发荧光情况进行观察时，在粘接剂旁边放置了正常牙本质样本作为对比，以便更好地对粘接剂自发荧光情况进行研究。图像观察采集使用逐层扫描的方法，扫描厚度为2 μm，获取的图像使用FV10-ASW 3.1 Viewer软件进行深度方向的叠加形成最终图像。

2 结果与讨论

2.1 结果

Single Bond 2粘接组、酸蚀不粘接组以及不酸蚀粘接组的激光共聚焦显微镜观察结果如图1所示。图像的灰度代表了荧光信号的强弱，灰度越高，荧光信号越强，反之亦然。在低倍视野中可以看到（图1，A，B，C），牙本质能够发出中等强度的荧光，而复合树脂的自发荧光信号则非常低。值得注意的是，在Single Bond 2粘接组和酸蚀不粘接组，牙本质和复合树脂之间可以观察到一条亮带。在高倍镜观察下（图1，a，b，c）Single Bond 2粘接组界面处能够观察到4层结构，分别为，荧光信号相对最弱的复合树脂（RC）；正常牙本质显示出一般强度的自发荧光，并且能够清楚的观察到牙本质小管（MD）；在视野中相对最明显的是位于牙本质表面的一个高荧光信号带，宽度在5 μm左右（箭头），此外，亮带之上还能够看到一层稍稍低于牙本质的荧光强度，但强于复合树脂的结构（A）。而在酸蚀不粘接组的界面中只能观察到3种结构，分别为中等荧光强度的牙本质（MD）、几乎不发荧光的复合树脂（RC）以及宽度为5 μm左右的高荧光信号带（DD）。不酸蚀粘接组中界面结构也只有3层，但是与酸蚀不粘接组相比，高荧光信号带消失，而在Single Bond 2组中存在稍稍低于牙本质的荧光强度，但强于复合树脂的结构则再次出现（A）。

图1 牙本质粘接界面自发荧光激光共聚焦显微镜观察结果Fig.1 Observed results of dentin-adhesive interfaces spontaneous fluorescence by laser confocal microscopy

3种自酸蚀粘接剂处理组的激光共聚焦显微镜观察结果如图2所示。除了正常牙本质（MD）和复合树脂部分（RC）是相同的之外，其界面自发荧光特征与全酸蚀粘接剂Single Bond 2有着较大的不同。在低倍镜下，3种自酸蚀粘接剂处理的界面处都能观察到一条自发荧光信号很强的带状区域，然而通过高倍镜可以发现，2种一步法自酸蚀粘接剂的粘接界面相似，都表现为3层结构，在牙本质和复合树脂间能够发现一条宽度在10 μm左右的高荧光信号带（图2，a，b箭头）。而2步法自酸蚀粘接剂SE Bond除了在界面处观察到强荧光信号带外，牙本质小管所在的位置也能发现很多高亮区域（图2，c），这是其他粘接处理组所没有的特征。

对各种粘接剂本身自发荧光的观察结果如图3所示。粘接剂边缘呈圆弧形，并与作对比用的牙本质片相邻。可以看出Single Bond 2的自发荧光强度稍低于牙本质（图3，A），而Easy One和S3 Bond的自发荧光强度则要明显弱于正常牙本质（图3，B，C）。在SE Bond的图像中出现了大面积的红色区域，这是荧光信号过高导致信号采集时过度曝光所致（图3，D，E）。图中RC为复合树脂，A为粘接剂，MD为正常牙本质。

图2 牙本质粘接界面自发荧光激光共聚焦显微镜观察结果Fig.2 Observed results of dentin-adhesive interfaces spontaneous fluorescence by laser confocal microscopy

图3 粘接剂自发荧光激光共聚焦显微镜观察结果（×100倍）Fig.3 Observed results of adhesive spontaneous fluorescence by laser confocal microscopy

2.2 讨论

自发荧光与经荧光染料染色的外源性荧光不同，其是物质本身的一种属性[5]。牙本质粘接界面含有多种不同成分组成的结构，根据相关研究结果可以推测牙本质粘接界面也会有其特殊的自发荧光特征，并且不同的粘接系统其粘接界面的自发荧光特征是不同的。按照这个假设，设计了观察牙本质粘接界面自发荧光的试验研究，以期得到一种新的观察分析牙本质粘接界面的方法。

Single Bond 2是一种经典的2步法全酸蚀粘接剂，Single Bond 2在牙本质粘接界面的结构及形成过程如下：牙本质表面首先在酸蚀剂的作用下，玷污层被溶解去除，牙本质小管口开放，牙本质表面轻度脱矿，胶原纤维暴露，在保持湿润的情况下涂布粘接剂，粘接剂渗入脱矿的牙本质，以包裹胶原纤维从而形成混合层（Hybrid layer），另外粘接剂还可以渗入牙本质小管内形成树脂突（Resin tags），在混合层上面则是粘接剂层（Adhesive layer），并以此与复合树脂（Resin composite）相接[13]。按照这几种结构在粘接界面的位置分布与激光共聚焦显微镜图像进行对照可推测，Single Bond 2组中，牙本质和复合树脂之间的2层结构应该就是混合层和粘接剂层，其中靠近牙本质一侧的应为混合层，而靠近复合树脂一侧的为粘接剂层。在激光共聚焦显微镜的观察下，混合层发射出很强的荧光，具有很高的辨识度（图1，a）。

在对照组中可以发现，在酸蚀组的界面也能观察到一条高荧光信号带，亮度略低于混合层，但宽度与混合层一样（图1，b）；而未经酸蚀只涂布粘接剂的牙本质则没有观察到此结构的出现，只存在发出弱荧光的粘接剂层（图1，c）。根据这个结果可以推测，牙本质在酸蚀剂的作用下发生了表层脱矿，因脱矿而暴露胶原的牙本质之自发荧光强于正常的矿化牙本质，从对粘接剂本身自发荧光的分析结果中也可以发现，Single Bond 2能够发出稍弱于正常牙本质的自发荧光（图3，A）。混合层是牙本质脱矿粘接剂渗入所形成的结构，由于粘接剂中不含有任何阻射成分[14]，其渗入非但不能阻挡脱矿牙本质的自发荧光，反而还因为本身的荧光增加了混合层的荧光强度，这可能是酸蚀后，粘接组中的混合层和自酸蚀组中的脱矿牙本质层都能发出较强荧光信号、同时混合层的荧光强度又略强于脱矿层的缘故。树脂突是粘接剂进入牙本质小管形成的结构，由于Single Bond 2本身的荧光强度略弱于牙本质，因此树脂突与牙本质的荧光交杂在一起，在激光共聚焦显微镜下难以分辨。

Easy One和S3 Bond是目前常用的2种一步法自酸蚀粘接剂，其溶解但是不去除玷污层。这种粘接剂中含有一定量的酸性功能单体，可在溶解玷污层的同时与牙本质发生化学结合[15]。因此，在一步法自酸蚀粘接剂的界面可以观察到粘接剂改性的玷污层。在这2种粘接剂处理组的自发荧光观察结果中，都能在牙本质表面看到一层高荧光信号带（图2，A，B，a，b）。而在对粘接剂本身自发荧光的观察中还能发现，Easy One和S3 Bond所发出的荧光明显弱于牙本质（图3，B，C），因此在粘接界面处的高荧光信号带是一步法自酸蚀粘接剂与玷污层和牙本质发生反应的结果，代表了粘接剂改性的玷污层。可见自发荧光法对一步法自酸蚀粘接剂形成的粘接界面也有很高的分辨能力。

SE Bond是目前国内临床上最常用的2步法自酸蚀粘接剂之一，分为底涂剂（primer）和粘合剂（bond）这2个部分，含有大量酸性单体的primer能够起到酸蚀溶解玷污层的作用，并能渗透到深层的牙本质中形成树脂突，然后再涂布起封闭作用的bond[14，16]。因此，在SE Bond的粘接界面含有包括primer改性的玷污层以及进入到牙本质小管中的粘接剂所形成的树脂突。从SE Bond界面的自发荧光观察结果可以发现，牙本质表面的高荧光信号带的位置应该就是primer改性的玷污层（图2，C，c）。在对SE Bond本身荧光进行观察后发现，其primer和bond都能发出很强的荧光（图3，D，E），这就能够解释激光共聚焦图像中粘接界面以下位于牙本质小管中的高荧光信号结构，这应该就是粘接剂所形成的树脂突。

3 结语

不同类型的粘接剂所形成的粘接界面的不同结构在激光共聚焦显微镜下都表现出了相应的自发荧光特征。与扫描电镜、透射电镜等常见的粘接界面观察方法相比，此种方法不需经过固定、干燥和脱水等步骤，既能保持粘接样本最原始的状态，又简化了样本制作步骤，并且能够获得一些特别的信息。使用CLSM观察后的样本还能再次使用，使得对同一样本进行动态监测成为可能，从而可更好地对牙本质粘接界面的老化过程进行观察分析。

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遗失声明

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特此声明。

粘接杂志编辑部

2017年9月1日

Observation of the dentin-adhesive interface using confocal laser scanning microscopy

ZHOU Wei, CHEN Ji-hua
(State Key Laboratory of Military Stomatology&National Clinical Research Center for Oral Diseases&Shaanxi Key Laboratory of Oral Diseases, Department of Prosthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an, Shaanxi 710032, China)

The dentin bonding specimens were prepared according to instruction of manufactures. Then bonding specimens were cut into the slices and polished. Then all the specimens were observed by the confocal laser scanning microscopy under the same condition. The results showed that the dentin-adhesive interfaces formed by different bonding agents exhibited special auto-fluorescence. Identification of different structure in the bonding interface was distinctive. So the observation of auto-fluorescence by confocal laser scanning microscopy could be a novel method for the analysis to the dentin-adhesive interface.

dental adhesive; dentin-adhesive interface; auto-fluorescence; confocal laser scanning microscopy

TQ430

A

1001-5922（2017）09-0022-05

2017-03-25

周唯（1986-），女，博士研究生，主治医师，研究领域及成果：牙科粘接修复材料技术、生物高分子材料。已发表中文核心期刊论文2篇，SCI论文3篇。E-mail：zw861231@163.com。

国家自然科学基金（81470773）；教育部创新团队及长江学者奖励计划（No.IRT13051）。