基于UPLC/Q-TOF-MSE分析小续命汤有效成分组的化学成分△

陈茜睿，杨志宏

(中国医学科学院 药用植物研究所，北京 100193)

·基础研究·

基于UPLC/Q-TOF-MSE分析小续命汤有效成分组的化学成分△

陈茜睿，杨志宏*

(中国医学科学院 药用植物研究所，北京 100193)

目的：快速阐明中药复方小续命汤的化学组成。方法：利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用技术(UPLC/Q-TOF-MSE)对小续命汤有效成分组进行了快速分析和成分鉴定。液相条件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，以0.1%甲酸水-乙腈为流动相进行梯度洗脱，柱温40 ℃，流速0.35 mL·min-1；质谱条件：采用ESI源，正、负离子模式下分别进行数据采集。结果：通过与对照品信息的提取辨识、与数据库数据的匹配指认以及对文献资料的比照分析，从小续命汤有效成分组中鉴定了42个化合物，主要包括黄酮、生物碱、三萜皂苷等类成分，并归属了各化合物的单味中药来源。结论：本研究比较全面地阐明了小续命汤有效成分组的化学组成，为此中药复方的质量控制提供参考，也为其深入的药效物质基础及药理作用研究奠定了基础。

小续命汤有效成分组；UPLC/Q-TOF-MSE；化学成分

小续命汤是由防风、麻黄、防己、人参、黄芩、桂枝、芍药、川芎、杏仁、附子、甘草、生姜12味中药组成的中药复方，是中医治疗中风及中风后遗症的经典方剂。近年来研究显示，小续命汤不仅对中风及中风后遗症具有明显的治疗作用，对阿尔茨海默病、糖尿病周围神经病变、顽固性高血压等其他疾病也具有一定疗效[1-5]。小续命汤有效成分组是小续命汤复方中与临床治疗脑卒中密切相关的药理活性成分[6]，近年来虽有文献[7-8]对小续命汤有效成分组中几味成分进行报道，但其中大部分化学成分仍未知。为了阐述该复方的药效物质基础和作用机制，进行其化学成分研究尤为迫切。

飞行时间质谱仪(Q-TOF-MSE)是高分辨质谱，其显著特征是既能准确测定化合物的精确分子量，又兼顾高灵敏度和高检测速度。超高效液相色谱串联飞行时间质谱技术(UPLC/Q-TOF-MSE)，即通过UPLC的高分离效率与Q-TOF-MSE的极高分辨率相结合，成为当前天然药物复杂体系中活性成分快速分离和鉴定的有力手段。本实验首次应用UPLC/Q-TOF-MSE技术对小续命汤有效成分组进行分析，结合色谱保留时间、精确分子质量、碎片离子信息，参考对照品的色谱、质谱行为和相关文献，对主要色谱峰进行归属和鉴定，对未知化合物进行结构推测。本研究较全面地阐明了小续命汤有效成分组的化学组成，为该复方开展后续的药效物质基础及药理作用研究奠定了基础。

1 材料

ACQUITYTMUPLC/Q-TOF SYNAPT G2 HDMS 联用系统，MassLynx V4.1质谱工作站(美国Waters公司)，ChemSpider数据库。

小续命汤有效成分组粉末由中国医学科学院药物研究所杜冠华教授惠赠。对照品：升麻苷(Prim-O-Glucosylcimifugin)，批号：PS08050601；黄芩苷(Baicalin)，批号：PS01260020；苦杏仁苷(Amygdalin)，批号：PS08082904；芍药苷(Paeoniflorin)，批号：PS13022801；甘草酸(Glycyrrhizic Acid)，批号：PS0126-0020；甘草素(Liquritigenin)，批号：PS15010601；黄芩素(Baicalein)，批号：PS0711-0025；汉黄芩素(Wogonin)，批号：PS14051603；千层纸素A(Oroxylin A)，批号：PS14052203，以上对照品购自成都普思生物科技有限公司。防己诺林碱(Fangchinoline)，批号：141215；苯甲酰新乌头原碱(Benzoylmesaconine)，批号：141124；人参皂苷Rc(Ginsenoside Rc)，批号：151021；甘草苷(Liquiritin)，批号：160127；异甘草苷(Isoliquiritoside)，批号：160129；千层纸素A葡萄糖醛酸苷(Oroxylin A-7-O-glucuronide)，批号：141220；汉黄芩苷(Wogonoside)，批号：141207，以上对照品购自上海融禾医药科技发展有限公司。白杨素(Chrysin，CHR)购自上海同田生物技术有限公司。盐酸甲基麻黄碱(Methylephedrine Hydrochloride)，批号：171247-200301，购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈、甲酸为色谱级，水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。

2 方法

2.1对照品溶液制备

精密称取各对照品1mg，以甲醇溶解至1mL，作为对照品贮备液，于4℃下避光保存。

2.2供试品溶液制备

小续命汤有效成分组供试溶液：精密称取有效成分组粉末20mg，于甲醇-水(80∶20，V/V)中超声溶解，配制成20mg·mL-1混悬液，以甲醇-水(50∶50，V/V)稀释为10mg·mL-1溶液后，于4℃下12000r·min-1离心10min，取上清液过0.22μm微孔滤膜。

2.3色谱条件

色谱柱：WatersACQUITYUPLCHSST3(100mm×2.1mm，1.8μm)；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈。洗脱程序为：0～10min，10%B；10～30min，10%→20%B；30～33min，20%B；33～41min，20%→35%B；41～46min，35%B；46～50min，35%→70%B；50～52min，70%→95%B。进样量为5μL；柱温为40℃；检测波长范围为190～320nm，流速为0.35mL·min-1。

2.4质谱条件

氮气为雾化、锥孔气；电喷雾电离：正、负离子模式；飞行管检测模式：W型；毛细管电压：正离子模式3.0kV，负离子模式2.5kV；锥孔电压：40V；萃取锥孔：4V；源温：100℃；脱溶剂气温度：350℃；反向锥孔气流：100L·h-1；脱溶剂气流：800L·h-1；扫描时间：1s；扫描时间间隔：0.15s；质荷比范围：m/z100～1200Da；锁定质量数：正离子模式m/z556.2771，负离子模式m/z554.2615。

3 结果

3.1小续命汤有效成分组主要色谱峰归属分析

应用UPLC/Q-TOF-MSE技术分析了小续命汤有效成分组供试品溶液，获得了其中多个成分的高分辨质谱及多级质谱数据。图1为正、负离子模式下小续命汤有效成分组供试品溶液总离子流图。通过分析样品的总离子流图，提取离子色谱图，获得特征碎片离子，再综合保留时间，比较对照品和供试品在时间点下的质谱图，进一步确认色谱峰的归属。结果显示，在42个色谱峰中，峰17、24、26、29、35、36、39来源于黄芩，峰8、12、14来源于防风，峰13、16来源于防己，峰1、2、3来源于麻黄，峰5、15、20、22、27、30、31来源于附子，峰23、25、32、33、34、38来源于人参，峰41来源于川芎，峰4来源于杏仁，峰6、7、28来源于芍药，峰10、18、19、37、42来源于甘草。

注：A.正离子模式；B.负离子模式。图1 小续命汤有效成分组样品总离子流图

3.2色谱峰的鉴定

通过与对照品比对鉴定，峰3为甲基麻黄碱，峰7为芍药苷，峰8为升麻苷，峰13为防己诺林碱，峰15为苯甲酰新乌头碱，峰17为黄芩苷，峰33为人参皂苷Rc，根据以上对照品总结的色谱和质谱规律，结合供试品中各色谱峰的精确的MS数据(分子式、精确分子量、特征二级和/或三级碎片离子峰)，再考虑到小续命汤有效成分组中已报道过的化学成分[9-16]，推测了各色谱峰的可能结构，见表1。从化合物的类别来看，黄酮类和生物碱类含量较高，对复方的贡献较大，并初步识别了色谱峰来源鉴定出的38个成分。包括10个黄酮类成分：黄芩苷(峰17)、甘草素(峰19)、千层纸素A葡萄糖醛酸苷(峰24)、汉黄芩苷(峰26)、黄芩素(峰29)、汉黄芩素(峰35)、白杨素(峰36)、千层纸素A(峰39)、甘草苷(峰10)和异甘草苷(峰18)。3个色原酮类成分：升麻素(峰12)、升麻苷(峰8)和5-O-甲基维斯阿米醇苷(峰14)。2个三萜类成分：甘草酸(峰37)和甘草次酸(峰42)。3个单萜类成分：芍药苷(峰7)、芍药内酯苷(峰6)和苯甲酰芍药苷(峰28)。12个生物碱类成分：麻黄碱(峰1)、伪麻黄碱(峰2)、甲基麻黄碱(峰3)、乌头碱(峰31)、次乌头碱(峰30)、新乌头碱(峰27)、苯甲酰新乌头碱(峰15)、苯甲酰次乌头碱(峰22)、苯甲酰乌头原碱(峰20)、附子灵(峰5)、粉防己碱(峰16)和防己诺林碱(峰13)。6个三萜皂苷类：人参皂苷Rg1(峰23)、人参皂苷Rb1(峰32)、人参皂苷Rb2(峰34)、人参皂苷Re(峰25)、人参皂苷Rc(峰33)、人参皂苷Rd(峰38)。1个氰苷类成分：苦杏仁苷(峰4)。1种挥发油类成分：藁本内酯(峰41)。

对于部分未知化合物，将其中4个未知化合物进行了初步推测。它们分别可能是：正离子模式下检测到的9、21、40号峰，以及负离子模式下检测到的11号峰。并推测它们分别为轮环藤酚碱、灯盏花甲素、黄芩新素Ⅱ以及芹糖基甘草苷。此外，通过比较对照品、小续命汤样品色谱峰出峰时间，发现峰4、10、18、19样品保留时间与对照品相同，但因其质谱碎片离子信号在样品与对照品中存在偏差，这可能是由于样品中组分相对复杂，影响了碎片离子信号的稳定程度，因而仅推测其可能为苦杏仁苷、甘草苷、黄芩苷、异甘草苷。

3.3黄酮类化合物的结构鉴定

根据峰17、24、26、29、35、36、39的精确质量数得到的化合物不饱和度均在10以上，推测均为黄酮类化合物。黄酮类成分的准分子离子峰大多为[M+H]+，其质谱碎裂特征主要是丢失中性分子CO和H2O。结构中有甲基取代基的化合物还可以丢失一分子甲基。同时，一些黄酮类成分还存在着逆狄尔斯-阿德尔反应(RetroDiels-Alderreaction，RDA)裂解。

化合物17正离子给出m/z447.0933[M+H]+，分子式为C21H18O11。推测为一连有葡萄糖醛酸结构的黄酮化合物，且属于单糖苷类，苷元可能含有邻二酚羟基。经与对照品比对，发现与黄芩苷的结构和质谱数据一致，17可能为黄芩苷。

化合物26正离子给出m/z461.1084[M+H]+，分子式为C22H20O11。化合物24正离子给出m/z483.0903[M+Na]+，分子式为C22H20O11，二者应是一对同分异构体。在黄酮母核的A环上均有葡萄糖醛酸基团，由于26与17分子结构相差一个CH2基团，两者可能为汉黄芩苷和千层纸素A葡萄糖醛酸苷，而只靠质谱数据很难将二者区分开，通过与已知的对照品进行质谱数据以及保留时间的对比，最终确定了化合物24为千层纸素A葡萄糖醛酸苷，化合物26鉴定为汉黄芩苷。

化合物29正离子给出m/z271.061[M+H]+，分子式为C15H10O5，表明为一黄酮类化合物，而非黄酮苷类。根据其化合物的分子质量和不饱和度推测3个氧原子的取代基为酚羟基取代，而非甲氧基取代，经与对照品比对，化合物29鉴定为黄芩素。

化合物35正离子给出m/z285.076 3[M+H]+，分子式为C16H12O5。与此相同的化合物39正离子给出m/z285.076 3[M+H]+，判断二者为一对同分异构体。根据其分子式和不饱和度推测此类化合物应为O-甲基化的黄酮类物质，而汉黄芩素和千层纸素A这两个黄酮类成分可能从黄芩中提取得到，与对照品对比，其保留时间及分子离子峰一致，判断化合物35为汉黄芩素，39为千层纸素A。

化合物36正离子给出m/z255.065 7[M+H]+，分子式为C15H10O5。通过与已知的对照品进行质谱数据以及保留时间的对比，最终确定了化合物36为白杨素。

表1 小续命汤有效成分组化合物质谱数据

表1(续)

4 讨论

小续命汤复方由12味中药组成，其中含有生物碱、黄酮、三萜皂苷等类复杂成分。要将这些不同类型的化合物用同一色谱条件进行分离，是相当困难的。基于对实验室原有的液相分离条件进行完善，并根据超高效液相色谱对流动相及色谱柱、柱温和流速的要求，考察了添加甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵等试剂对分离的影响，并比较了甲酸的不同酸度对分离的影响，最终确定了以0.1%甲酸-乙腈为流动相梯度洗脱效果最佳。同时，分别进行了柱温30、35、40 ℃对于分离的影响，确定了柱温为40 ℃时分离效果最佳。实验结果表明，不添加铵盐，仅调节流动相pH值，能够使有效成分组中各成分得到较好分离，并得到良好的响应信号。

本实验对主要色谱峰的来源进行了归属和鉴定，共归属了42个主要色谱峰。尽管小续命汤组方各单味药量相差不多，但对于全方的化学贡献却明显不同，其中防己、防风、黄芩、芍药、甘草贡献较大。而复方BPI图中仍有一些色谱峰并未找到与其相对应的物质归属，这可能是由于该方组方成分复杂及提取过程中产生多种物质间反应，导致尚存在一定量的未鉴定成分。同时，本文首次报道了由小续命汤有效成分组中检定出如下成分：乌头碱，新乌头碱，次乌头碱，苯甲酰乌头原碱，苯甲酰新乌头碱，苯甲酰次乌头碱，附子灵，人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1，甲基麻黄碱，芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷。

结合文献分析，已鉴定的化合物中黄芩素抑制黑质星形胶质细胞的生成，并能增加多巴胺能神经元的数量，同时其对谷氨酸引起的神经元损伤具有保护作用，芍药苷有抑制胶质细胞激活、保护神经元免受损伤的作用，千层纸素A具有促神经发生作用。这些化合物可能通过协同或互补在小续命汤中发挥治疗脑缺血、阿尔茨海默病、高血脂等疾病的作用。

UPLC/Q-TOF-MSE技术可以快速、方便、有效地对中药复方组分进行特征图谱表征和结构分析，利用这一方法不仅对小续命汤复方的研究有着重要的贡献，对其他中药复方现代化的研究也有着异曲同工之处，且具有巨大的应用潜力。然而此方法仍存在一些不足之处，如无法区分一些同分异构体、手性化合物，无法提供化合物的立体构型。为了得到化合物的具体结构，仍需使用其他方法加以支持。

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UPLC/Q-TOF-MSEBasedAnalysisofChemicalCompositionofAF-Xiao-Xu-MingDecoction

CHEN Xirui，YANG Zhihong*

(Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100193，China)

Objective：In order to clarify the chemical composition and the source of active component Xiao-Xu-Ming decoction (AF-XXMD) quickly and comprehensively，whole and individual herbs of AF-Xiao-Xu-Ming decoction were analyzed by Ultra-Performance Liquid Chromatography with Quadrupole-Time-of-Flight Mass Spectrometry(UPLC/Q-TOF-MSE).Methods：Under identical experiment conditions，chromatography results were compared between experiment groups.A Waters ACQUITY UPLC HSS T3 column (100 mm×2.1 mm，1.8 μm) was used with 0.1% formic acid solution (A) -acetonitrile (B) as the mobile phase for gradient elution.The flow rate was set to 0.35 mL·min-1and the column temperature was maintained at 40 ℃.Electrospray ion (ESI) source was applied for the qualitative analysis under the positive and negative ion mode.Results：Finally，based on comparison with standard samples，database matching analysis and reviewing relevant literature，42 compounds were identified from AF-Xiao-Xu-Ming decoction.The results implied that flavonoids，alkaloids and triterpenoid saponins were the main components in the effective part of AF-Xiao-Xu-Ming decoction.The herbal sources of these peaks were assigned.Conclusion：This established method is simple and rapid for elucidation the constituents of AF-Xiao-Xu-Ming decoction and the results could be used for the quality control and the further material basis research for AF-Xiao-Xu-Ming decoction.

AF-Xiao-Xu-Ming decoction；UPLC/Q-TOF-MSE；chemical composition

国家自然科学基金(81273654，81473579，81102879)；国家重大新药创制专项(2013ZX09103002-022)

] 杨志宏，副研究员，硕士生导师，研究方向：药物代谢动力学及中药复方配伍机制；Tel：(010)57833219，E-mail：zhyang@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.012

2016-04-13)

*[