拟层孔菌(Fomitopsis sp.)促进沉香的形成及其生物学特性△

陈旭玉，杨云，刘洋洋，冯剑，刘培卫，魏建和*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所(中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，濒危药材繁育国家工程实验室)，北京 100193；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所海南分所(海南省南药资源保护与开发重点实验室，国家中医药管理局沉香可持续利用重点研究室)，海南 海口 570311)

·专题·

拟层孔菌(Fomitopsis sp.)促进沉香的形成及其生物学特性△

陈旭玉1，2，杨云1，2，刘洋洋1，2，冯剑2，刘培卫2，魏建和1，2*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所(中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，濒危药材繁育国家工程实验室)，北京 100193；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所海南分所(海南省南药资源保护与开发重点实验室，国家中医药管理局沉香可持续利用重点研究室)，海南 海口 570311)

目的：为了获得促进白木香(Aquilariasinensis)形成沉香的真菌及其生物学特性。方法：采用PDA培养基分离并纯化真菌及菌液接种到白木香树进行功能验证。形态学特征结合ITS序列进行真菌鉴定和平板培养法测定真菌生物学特性。结果：分离到1株真菌 ASAF01，其菌液输到白木香6个月后能促进沉香的形成。ASAF01鉴定为拟层孔菌(Fomitopsissp.)，属于拟层孔菌属(Fomitopsis)，拟层孔菌科(Fomitopsidaceae)，多孔菌目(Polyporales)，伞菌纲(Agaricomycetes)，担子菌门(Basidiomycota)，其菌最适在马铃薯葡萄糖培养基上生长，最适温度是35 ℃，最适pH值为7，最适碳源和氮源为可溶性淀粉和酵母浸膏。结论：拟层孔菌(Fomitopsissp.)ASAF01能促进白木香结香。

白木香；真菌促进结香；鉴定；拟层孔菌(Fomitopsissp.)

白木香Aquilariasinensis(Lour.) Gilg是国家二级重点保护野生植物，是珍贵国产药材沉香的唯一植物资源。沉香具行气止痛，温中止呕，纳气平喘之功效[1]。沉香的形成非常特殊，健康的白木香不能产生沉香类物质，只有受到物理伤害、化学伤害及真菌侵染等外界的伤害后才诱导结香。由于沉香形成的特殊性，致使沉香的结香技术广泛被关注。

沉香的结香技术有物理结香(刀砍，火烙等)，化学结香(乙酸，甲酸等)和微生物结香(色二孢，黄绿墨尔菌)等。国内外已报道微生物促进结香，1952年，Bhattacharya提出白木香结香与真菌感染有关[2]。1976年，广东省植物研究所发现沉香的形成与植物感染真菌有关，如黄绿墨耳菌感染白木香木材伤口后能加速沉香物质(倍半萜类化合物和色酮类化合物)形成[3，4]。1977年，Gibson分离一株内生真菌(CytosphaeramangiferaeDied)能使健康的白木香结香[5]。2003年，Tabata等利用5种镰刀菌进行人工诱导产生沉香[6]。冯乃宪从白木香中筛选出蒂腐色二孢(Botryosphaeriarhodina)红褐肉座菌(Hypocreajecorina)和2株木霉并证实能促进沉香形成[7]。陈旭玉分离一株拟盘多毛孢(Pestalotiopsisvirgatula) 6个月后能促进沉香的形成[8]。许多科研工作者已经证实真菌可以促进结香，本文研究的目的是筛选出促进结香的优质真菌，为应用真菌结香和利用真菌促进高品质沉香奠定基础。

1 材料和方法

1.1材料

真菌从海南省万宁市南药园采取砍伤3年的沉香样品中分离，样品经中国医学科学院药用植物研究所植物资源研究室朱平教授鉴定。

1.2方法

1.2.1仪器和方法 WT3003千分之一电子天平秤 (赛多利斯科学仪器(北京有限公司)；JY02S紫外分析仪型号 (北京君意东方电泳设备有限公司)；Mill—QAdvantageA10超滤水净机 (北京五洲东方科技发展有限公司)；SB25—12DTDN型超声波清洗机(宁波新兰生物科技股份有限公司)。

试剂主要有沉香对照药材(批号121222-201102)购自中国食品药品检定研究院，其余为分析纯。

1.2.2白木香结香真菌 ASAF01的鉴定 挑取菌丝ASAF01接种到PDA液体培养基中，室温28℃、150r·min-1振荡培养3～15d，收集菌丝，过滤并干燥，用液氮研磨成细粉，利用植物基因组试剂盒(天根生化科技有限公司) 提取总DNA。以ITS1(5′-TCCGATGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TC-CTCCGCTTATTGATATGC-3′) 为引物进行 PCR扩增。扩增体系为：DNA buffer1μL；Master Mix (北京天根公司)12.5μL；引物(10mol·L-1) 各1μL；灭菌dd H2O9.5μL，共25μL。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸7min。PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将获得的序列与 Gen Bank 数据库中的序列进行同源性比较[9]。

1.2.3薄层鉴定 将拟层孔菌(Fomitopsissp.)接种于白木香树干6个月后，离输液口5cm处砍下，剖香，然后进行薄层分析，具体方法为：取沉香样品粉末1g置于具塞三角瓶中，加甲醇25mL，超声处理60min，滤液定容至25mL，作为供试品溶液。另取沉香对照药材1g，同法制成沉香对照药材溶液。取6，7-二甲氧基-2(2-苯乙基)色酮加甲醇制成每毫升含0.05mg的对照品溶液。吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各5μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-乙醚(10∶1)为展开剂，展开2次，取出晾干，置紫外灯光(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显示相同颜色的荧光斑点[8]。

1.2.4不同培养基对拟层孔菌(Fomitopsissp.)菌丝生长的影响 选择马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、燕麦琼脂培养基(OA)、玉米粉琼脂培养基(CMA)、察氏琼脂培养基(Czapek)、胡萝卜琼脂培养基(CA)共5种培养基，接种直径为5mm菌块至培养皿中心，30℃恒温箱中培养，3d和5d后采取十字交叉法测量菌落直径，每处理3次重复。

1.2.5不同温度对拟层孔菌(Fomitopsis sp.)菌丝生长的影响 取5mm菌块置于PDA平板中心，然后分别放在15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃和45℃恒温培养。3d和5d后采取十字交叉法测量菌落直径，每处理3次重复。

1.2.6不同pH值对拟层孔菌(Fomitopsissp.)菌丝生长的影响 用0.1mol/LHCl和0.1mol/L NaOH调节PDA 培养基，制成pH值分别为5、6、7、8、9、10、11的PDA培养基，灭菌后重新调pH值，将5mm菌块于不同 pH值的 PDA 平板中心上，30℃恒温箱中培养，3d和5d后采取十字交叉法测量菌落直径，每处理3次重复[10]。

1.2.7不同碳源对拟层孔菌(Fomitopsissp.)丝生长的影响 采用察氏培养基作为基础培养基，将培养基中的蔗糖以甘露醇、D-山梨醇、乳糖、果糖、葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖等不同的碳源等量代替制成平板，将5mm菌块置于平板中央，30℃下培养3d和5d后采取十字交叉法测量菌落直径，每处理3次重复。

1.2.8不同氮源对拟层孔菌(Fomitopsissp.)菌丝生长的影响 采用察氏培养基作为基础培养基，将培养基中的硝酸钠以牛肉浸膏、酵母浸膏、蛋白胨、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、等不同的氮源等量代替制成平板，将5mm菌块置于平板中央，30℃下培养3d和5d后采取十字交叉法测量菌落直径，每处理3次重复。

2 结果

2.1结香真菌的分离和鉴定

ASAF01在PDA培养基上的菌落为白色，匀质状，边缘整齐；菌丝纤细，有叉状分枝，不易产孢。ASAF01测序获得的基因序列长度为656bp(见图1)，将获得的序列与Genbank数据库进行 Blast 比对，结果显示其序列与Fomitopsismeliae(AccessionNo.HQ248221)同源性达97%，与Fomitopsiscf.meliae(AB540581；GQ982889；FJ372675和FJ372673.1)同源性达96%。通过形态特征和分子特征将其鉴定为拟层孔菌(Fomitopsissp.)，现已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC NO.7802。

注：A.ASAF01真菌的菌落；B.拟层孔菌(Fomitopsis sp.)菌丝形态；C.ASAF01 菌株的 PCR 产物图1 ASAF01真菌的鉴定

2.2结香真菌的结香功能验证及薄层鉴定

拟层孔菌(Fomitopsissp.)接种6个月后即可促进白木香结香且形成的沉香中间不易腐烂(见图2)。

图2 拟层孔菌(Fomitopsis sp.) ASAF01 菌株促进沉香的形成

注：BK为健康的白木香；ST为色酮对照；CK为中国药典规定的对照药材；IW为ASAF01菌株接种6个月的沉香；EA为优等的野生沉香图3 拟层孔菌(Fomitopsis sp.) ASAF01诱导形成沉香的薄层鉴定

经薄层鉴定后，拟层孔菌(Fomitopsissp.)接种6个月后获得的沉香与野生沉香和对照药材获得相似斑点(见图3)，说明该菌株能促进沉香的形成。

2.3结香真菌的生物学特性

2.3.1不同培养基对拟层孔菌(Fomitopsissp.)生长的影响 拟层孔菌(Fomitopsissp.)在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上生长速度最快，而在玉米粉琼脂培养基(CMV)上生长最慢(见图4)。

图4 拟层孔菌(Fomitopsissp.)菌丝在不同培养基上生长的结果

2.3.2不同温度对拟层孔菌(Fomitopsissp.)生长的影响 拟层孔菌(Fomitopsissp.)在15～40℃范围内均能生长，最适温度为35℃，45℃菌丝生长缓慢(见图5)。

图5 拟层孔菌(Fomitopsissp.)菌丝在不同温度上生长的结果

2.3.3不同pH值对拟层孔菌(Fomitopsissp.)生长的影响 拟层孔菌(Fomitopsissp.)菌丝在pH5～11范围内均能生长，最适pH值7(见图6)。

图6 拟层孔菌(Fomitopsis sp.)菌丝在不同pH值上生长的结果

2.3.4不同碳源对拟层孔菌(Fomitopsissp.)生长的影响 不同碳源对拟层孔菌(Fomitopsissp.)菌丝生长影响不大，最适碳源是可溶性淀粉(见图7)。

图7 拟层孔菌(Fomitopsissp.)菌丝在不同碳源上生长的结果

2.3.5不同氮源对拟层孔菌(Fomitopsissp.)生长的影响 不同氮源对拟层孔菌(Fomitopsissp.)菌丝生长影响不大，最适氮源为酵母浸膏(见图8)。

图8 拟层孔菌(Fomitopsissp.)菌丝在不同氮源上生长的结果

3 讨论

通过对拟层孔菌(Fomitopsissp.)生物学特性研究结果表明，拟层孔菌(Fomitopsissp.)在温度15～35℃都能生长，35℃是菌丝生长最适温度，说明该菌生长的条件符合在热带地区结香。拟层孔菌(Fomitopsissp.)菌丝在pH5～11的固体培养基能生长，在PH2-11的液体培养基上也能生长，说明该菌对环境的耐受力很强。

2010年，本课题组提出“白木香防御反应结香假说”[11]：即伤害或真菌侵染均是作为激发子诱导白木香产生防御反应，产生具有抑菌活性的防御物质 (药材沉香的主要化学成分)，这些防御物质与细胞其他组分复合形成的侵填体堵塞了次生木质部的导管和维管束，以抵御外界物理、化学伤害或真菌侵染对白木香的进一步损伤。作者从白木香树分离了1株拟层孔菌(Fomitopsissp.)并证实能促进沉香的形成。拟层孔菌(Fomitopsissp.)也是一种腐木菌[12]，该菌是64种腐朽菌中降解木材最高的一种[13]。在林木和农作物上常引起褐腐病[14，15]。另外，拟层孔菌(Fomitopsissp.)能产生纤维素酶[16，17]，具有降解纤维素的作用。根据假说可以推测沉香的形成可能是拟层孔菌(Fomitopsissp.)产生纤维素酶降解植物纤维诱导白木香防御反应形成沉香，但其机制有待于研究。

[1] 国家药典委员会.中国人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社.2010：184-185.

[2] Bhattacharya.On the formation and development of agar in Aquilaria agalocha[J].Sci Cul，1952：240-242.

[3] 华南植物研究所.初步揭开沉香结香的秘密[J].植物学报，1976，18(4)：287-291.

[4] 戚树源，林立东，胡厚才.白木香中色酮类化合物的形成[J].中草药，2000，31(9)：658-659.

[5] Gibson I A S.The role of fungi in the origin of oleoresin deposits (Agaru) in the wood of Aquillaria agallocha (Roxb)[J].Bano Biggyn Patrika，1977，6(1)：16-26.

[6] Tabata Y，Widjaja E，Mulyaningsih T，et al.Structural survey and artificial induction of aloeswood[J].Wood research，2003，90：11-12.

[7] 冯乃宪.沉香内生真菌的初步研究[D].南昌：南昌大学，2008.

[8] 陈旭玉，杨云，刘洋洋，等.促进沉香形成真菌 ASAF05的分离、筛选和鉴定[J].中国药学杂志[J].2014，40(13)：1118-1120.

[9] Chen X Y，Qi Y D，Wei J H，et al.Molecular identification of endophytic fungi from medicinal plant Huperziaserrata based on rDNA ITS analysis[J].World Journal of Microbiology Biotechnology，2011，27：495-503.

[10]陈旭玉，魏建和，黄娴，等.温郁金弯孢霉叶枯病病原菌(Curvulariaclavata)生物学特性研究[J].西南农业学报，2014，27(4)：1536-1538.

[11]张争，杨云，魏建和，等.白木香结香机制研究进展及其防御反应诱导结香假说[J].中草药，2010，41(1)：156-158.

[12]Ma F Y，Xiong ZH，Zheng Y B，Yu X C，Zhang X Y.Repeated batch process for biological treatment of black liquor using brown-rot basidiomyceteFomitopsissp.IMER2[J].World Journal of Microbiology Biotechnology，2008，24：2627-2632.

[13]Grand L F，Vernia C S.Biogeography and hosts of poroid wood decay fungi in North Carolina：species of Fomes，Fomitopsis，Fomitella and Ganoderma[J].Mycotaxon，2006，94：231-234.

[14]Xiong Z，Zhang X，Wang H，Ma F.Li L，Li W.Application of brown-rot basidiomycete Fomitopsis sp.IMER2forbiological treatment of black liquor[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2007，104(6)：446-50.

[15]Roccotelli A，Schena L，Sanzani S M，Cacciola S O and Ippolito A.Fomitopsissp.causing brown rot in wood of living citrus trees reported for first time in southern[J].Italy New Disease Reports.2010，22，13.

[16]Deswal D，Khasa Y P，Kuhad R C.Optimization of Cellulase production by a brown rot fungusFomitopsissp.RCK2010under Solid State Fermentation[J].Bioresource Technology，2011，102(10)：6065-72.

[17]Deswal D，Gupta R，Kuhad R C.Enhanced exoglucanase production by brown rot fungusFomitopsissp.RCK2010and its application for cellulose saccharification[J].Applied biochemistry and biotechnology，2012，168(7)：2004-2016.

EffectofFomitopsissp.onpromotingAgarwoodFormationandItsBiologicalCharacteristics

CHEN Xuyu1，2，YANG Yun1，2，LIU Yangyang1，2，FENG Jian2，LIU Peiwei2，WEI Jianhe1，2*

(1.Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education & National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China;2. Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine & Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Agarwood Sustainable Utilization, Hainan Branch Institute of Medicinal Plant, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Haikou 570311, China)

Objective：In order to screen a fungi to promote the agarwood formation inAquilariasinensis.Methods：The fungi were isolated by PDA medium，and then inoculated toA.sinensisto verify whether the fungi could promote agarwood formation.The fungi were identified based on morphological characteristics and DNA sequences analysis，then the biological characteristics observed by flat method.Results：ASAF01 strain could promote agarwood formation and was identified asFomitopsissp.，belonging toFomitopsis，Fomitopsidaceae，Polyporale，Agaricomycetes，Basidiomycota.The results of biological characteristics showed that the mycelia ofFomitopsissp.grew fastest in the PDA medium.The optimum temperature for the mycelial growth was 35 ℃ and the optimum pH value was 7.The optimal carbon sources and carbon source were soluble starch and yeast extract.Conclusion：Fomitopsissp.ASAF01 can promote agarwood formation.

Aquilariasinensis；fungi promote agarwood formation；identification；Fomitopsissp.

国家自然科学资金(81303312)项目资助；海南省应用技术研发及示范推广专项(ZDXM2015059)项目资助；海南省重大科技计划项目(ZDKJ2016004)；中组部“万人计划”(99950534)

] 魏建和，教授，研究方向：药用植物基因资源与分子育种；Tel：(0898)31589009，E-mail：wjianh@263.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.8.009

2017-01-08)

*[