缺氧对细胞TH17在脊柱结核复发机制的影响

索南昂秀+曹振宇+祁腾民

[摘要] 目的 探討TH17细胞及细胞因子在缺氧环境下在脊柱结核患者复发机制的影响。 方法 选择2015年9月～2017年1月青海省人民医院就诊的脊柱结核病患者46例，依据临床表现和实验室检查将其分为初发组（27例）和复发组（19例）。对患者TH17细胞及细胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ进行检测，并对CCL20、CCL22、CCL27进行检测，观察Th17细胞趋化指数变化及Th17细胞表达CCR受体及CCL配体的关系。 结果 与初发组比较，复发组患者的TH17细胞比例明显升高（P < 0.05），细胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α含量明显上升（P < 0.01），IFN-γ含量下降（P < 0.01）。复发组CCL20、CCL22、CCL27的浓度明显高于初发组（P < 0.01），免疫荧光染色及扫描定量分析发现CCL20、CCL22、CCL27在复发组患者的骨细胞中表达高于初发组（P < 0.01），细胞形态与初发组染色结果均相似。 结论 可将Th17细胞用于结核病及结核复发的诊断、结核病不同病程的区分及患者免疫功能的评估。可将IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α、IFN-γ、CCL20、CCL22、CCL27、CCR受体及CCL配体作为缺氧条件下脊柱结核复发新的诊断标志物，用于结核病复发的早期诊断。

[关键词] 缺氧；TH17；脊柱结核；复发

[中图分类号] R687.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）08（c）-0096-06

[Abstract] Objective To discuss the effect of TH17 cells and cytokines on the recurrence of spinal tuberculosis was evaluated in hypoxic environment. Methods From September 2015 to January 2017， in Qinghai People's Hospital， 46 patients with spinal tuberculosis were selected， they were divided into primary group （27 cases） and recurrence group （19 cases） according to clinical manifestation and laboratory examination. TH17 cells and cytokines including IL-6， IL-1β， IL-23， TNF-α， IFN-γ in patients and the CCL20， CCL22， CCL27 were detected. The relationship of chemotactic index of Th17 cells and the Th17 expression of CCR receptor and CCL ligand were evaluated. Results Compared with primary group， the percentage of TH17 cells increased significantly of patients in recurrence group （P < 0.05）， the content of cytokines including IL-6， IL-1， IL-23， TNF-α increased significantly （P < 0.01）， the content of IFN-γ decreased （P < 0.01）. The concentration of CCL20， CCL22 and CCL27 from recurrent group were significantly higher than primary group （P < 0.01）， immunofluorescence staining and scanning quantitative analysis showed that the expression of CCL20， CCL22 and CCL27 in bone cells of patients in recurrent group were higher than in primary group （P < 0.01）， cell morphology was similar with the the staining results of primary group. Conclusion Th17 cells can be used for the diagnosis of tuberculosis and tuberculosis recurrence， differentiation of tuberculosis courses and evaluation of immune function of patients. IL-6， IL-1β， IL-23， TNF-α， IFN-γ， CCL20， CCL22， CCL27， CCR receptors and CCL ligands can be used as a new diagnostic marker for the recurrence of spinal tuberculosis in hypoxia， and for the early diagnosis of tuberculosis recurrence.

[Key words] Hypoxia； TH17； Spinaltuberculosis； Recurrenceendprint

近些年来，结核病发病率呈逐年递增趋势，且结核病情越来越趋于严重，该种疾病较为隐匿，一般严重时才被发现，故致残率高，若早期不能得到发现并接受及时的治疗，将会对患者、家庭及社会造成沉重的负担。脊柱结核患者一般从肺部结核转移发展而来，病情极为隐匿，该种疾病为结核性病变的最严重的表现形式，发病率约为所有结核病总数的45%[1]。相关研究表明脊柱结核病的骨性组织及血液中存在Th17细胞，尤以在脊柱结核病的骨性组织中浓度较高[2]。脊柱结核病患者体内的Th17细胞的来源主要包括两个途径：①自身局部组织Th17细胞进行分化增殖；②在CCL20-CCR受体、CCL22-CCR受体和CCL27-CCR受体趋化轴的作用下及成骨细胞的自身趋化作用下，将Th17细胞从患者血液中募集到达病骨组织中[3]。脊柱结核病的骨性组织及血液中的趋化因子受体及配体在炎症因子的作用下表现为上调，其中上调Th17的细胞因子为IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α，而下调抑制细胞Th17的因子为IFN-γ[3]。

本项研究拟通过体外实验观察监测在缺氧条件下IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ对Th17细胞的具体调节作用，以及CCL20、CCL22、CCL27、CCR受体及CCL配体对脊柱结核病复发的调节程度进行研究监测，以此探讨在高原缺氧环境条件下脊柱结核病复发的原因与相关部分作用机制，从而为高海拔缺氧环境条件下的脊柱结核病的治疗寻找以及提供基础理论研究的基础，而且为该类疾病的复发提供科学的监测指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年9月～2017年1月青海省人民医院就诊的脊柱结核病患者46例，依据临床表现和实验室检查将其分为初发组（27例）和复发组（19例）。初发组男14例，女13例，年龄25～72岁，平均（38.9±14.2）岁；复发组男10例，女9例，年龄30～68岁，平均（39.2±15.6）岁。两组性别、年龄、淋巴细胞数等一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。所有患者入院后进行的TSPOT.TB结果和TST结果均为阳性，诊断均参照中华医学会结核病学分会制订的结核诊断和治疗指南中的标准。所有脊柱结核病的患者，同时可伴有肺部结核（非活动期）及其他部位结核。其中临床诊断包括脊柱磁共振及CT影像学阳性，而患者肺部影像学检查结果则提示可能为肺结核相关性病变，且完善γ-干扰素试验（+）、结核菌素试验（TST）、抗结核抗体检查阳性，经诊断性治疗有效后可伴有轻度咳嗽咳痰等肺结核可疑症状的病例；其他结核确诊病例包括患者痰液涂片抗酸染色检查（±），而培养结核杆菌（+）及病变部位病理学诊断为结核杆菌病变的病例[4-6]。同时排除肝、肾功能严重障碍性疾病的患者，自身免疫性疾病患者，应用糖皮质激素等免疫抑制剂的患者。

1.2 方法

1.2.1 Th17细胞的检测

选取抗凝管（EDTA）对来自于高海拔地区缺氧条件下的脊柱结核病初发和复发的患者抽取静脉血液6 mL，抽血时间均为该类患者住院并已经确诊后的次日清晨，确诊条件为：①影像学资料及入院行结核菌素试验（+）；②完善γ-干扰素试验（+）。抽取患者的血液样本必须严格控制于室温下保存，以及抽血当天必须及时进行检测。

1.2.1.1 样本前处理 ①选用RPMI对已选取的250 μL全血标本进行1∶1等体积稀释。②将稀释液加入流式检测的专用管中，并且依次加入：15 μL 1 μg/mL PMA工作液，10 μL 50 μg/mL Ionomycin工作液，6.6 μL 0.2 mg/mL Monensin工作液。将以上试验液进行混匀，并放置于室温条件下的CO2培养箱中进行培养，时长5～7 h。③将以上试验液从培养箱中取出后再依次加入：CD3-PC5 抗体10 μL，CD45-ECD 抗体10 μL，CD4-FITC 抗体10 μL，在室温条件下将以上试验液避光孵育约15～20 min。④再将每个试验管中分别加入固定液（120 μL Fix&Perm中的Reagent A），并在室温条件下避光孵育约15～20 min。⑤再将每管中分别加入4 mL PBS，取1000 g放入离心机离心8 min，并弃除上清。⑥再将每管中分别加入固定液（120 μL Fix&Perm中的Reagent B），同时各管中再分别加入相应的IL-17-PE，将以上试验液在室温下避光孵育10 min。⑦再将每管中分别加入3 mL PBS，取1000 g放入离心机离心8 min，并予以弃除上清。⑧最后选取1.0 mL PBS重悬细胞进行上机检测。

1.2.1.2 Th17 细胞上机检测 ①选择Navios操作菜单中的Th17细胞检测程序；②以 CD45+CD3+的T淋巴细胞设置；③分析Th17细胞（CD4+IL-17+）的含量。

1.2.2 IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ的检测

①选用枸橼酸钠抗凝管抽取高海拔地区缺氧环境下的脊柱结核病初发和复发患者静脉血液6mL，抽血时间均为该类患者住院后并已经确诊后的次日清晨，確诊条件为：影像学资料及入院行结核菌素试验（+）；完善γ-干扰素试验（+）。②抽取脊柱结核复发患者静脉血6 mL，取1000 g置于离心机进行离心7 min后立即收集上清液250 μL，再将收集好的上清液进行低温冻存（-80℃）。③将待测样本和鼠抗人IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ试剂盒恢复至室温。④稀释标准品并分别设置复孔加样，每个浓度3孔，共计15孔。并分别设置空白对照孔，待测样本孔。⑤再于酶标板上首先加入已经稀释的样本液体40 μL，然后再加入15 μL样本，并在恒温水浴箱中封板孵育40 min，揭开封板膜并且弃去液体，甩干，再于每孔中加入已经稀释好的洗涤液并且静置25 s后弃去。⑥再于每孔中分别加入IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ酶标试剂液体40 μL（空白孔除外）。⑦再选用封板膜封板，并放置于恒温水浴箱中，孵育时间约为25 min，仔细揭开封板膜并且抛去液体，甩干，再于每孔加入稀释好的洗涤液并且静置25 s后抛去。⑧再于每孔中分别加入40 μL的显色剂A，再加入40 μL的显色剂B，混匀后再留置于室温条件下进行避光显色20 min。⑨再于每孔分别加入40 μL终止液予以终止反应，立即予以酶标仪进行450 nm波长测定吸光度（OD）值。⑩最后依据标准品已知浓度拟合曲线换算出各样本中IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ的含量，所有检测报告均以（ng/L）为单位[7]。endprint

1.2.3 CCL20、CCL22、CCL27、CCR受体及CCL配体的检测分析

采用ELISA的方法对CCL20、CCL22、CCL27在进行了检测；采用免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观察成骨细胞表达CCL20、CCL22、CCL27的细胞形态。

具体方法：①提取缺氧条件下的脊柱结核初发患者和复发患者的病变部位骨组织；②从骨组织中分离提取出成骨细胞并进行培养，3 d后取出并进行初次漂洗固定；③再次漂洗后滴加血清液并进行孵育，并分别滴加CCL20、CCL22、CCL27抗体并进行过夜（温度进行控制）；④再次漂洗，并滴加标记的免疫荧光二抗进行避光孵育，1 h后漂洗；⑤封片后置于激光共聚焦显微镜下，在波长488 nm的激发下进行比较观察；⑥使用Image-Pro plus软件分别对初发组和复发组的骨细胞CCL20、CCL22、CCL27进行扫描测定。

检测脊柱结核患者初发组和复发组病骨细胞表面表达的CCR4细胞比例，以及分别加入α-CCL20、α-CCL22及α-CCL27后Th17细胞的趋化性表现。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 20.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率表示，采用χ2检验。通过 ROC 曲线评价各指标用于区分结核病不同病程的诊断效益。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 初发组和复发组Th17细胞的表达情况

复发组Th17细胞的比例[（13.08±0.70）%]明显高于初发组[（11.31±0.40）%）]，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 初发组和复发组的IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ表达情况

复发组IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α的表达明显高于初发组，差异有统计学意义（P < 0.05），而IFN-γ的表达低于初发组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。这一变化趋势和Th17细胞的变化趋势相同，说明Th17细胞及其细胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ在抗结核感染过程中的重要作用。

2.3 初发组和复发组CCL20、CCL22、CCL27的表达情况

复发组CCL20、CCL22、CCL27的浓度明显高于初发组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。说明CCL20、CCL22、CCL27在缺氧状态下对Th17细胞的趋化作用起到了重要的作用。

2.4 免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观察成骨细胞表达CCL20、CCL22、CCL27的细胞形态

免疫荧光染色结果：CCL20、CCL22、CCL27在复发组患者的成骨细胞中表达较初发组为高，细胞形态与初发组染色结果相似。经免疫荧光染色鉴定，CCL20、CCL22、CCL27在缺氧环境下脊柱结核复发患者骨组织中明显多于初发组。见图1（封三）。

2.5 初发组和复发组CCL20、CCL22、CCL27的定量分析

复发组骨细胞中CCL20、CCL22、CCL27的相对光密度值明显高于初发组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

2.6 初发组和复发组中Th17细胞趋化比例情况

脊柱结核复发组病骨细胞表面表达的CCR4细胞比例为（67.3±4.9）%，初发组为（52.6±5.5）%，两组差异有统计学意义（P < 0.05）。说明复发组患者骨细胞中的细胞趋化因子受体表达显著高于初发组。

Th17细胞趋化指数变化：初发组分别加入α-CCL20、α-CCL22及α-CCL27后较复发组Th17细胞趋化性均减弱，细胞趋化指数均下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表4。

3 讨论

目前随着全世界医学领域外科学技术和外科内固定技术的不断高速的发展，外科手术方案逐渐成为治疗脊柱结核并患者的首选方法，这是近几十年来在治疗脊柱结核病方面的一大突破性进展，常规条件下在对于此类患者进行有效的抗结核药物的治疗基础之上，尚可以采取对具备局部手术指征的脊柱结核病患者进行及时而且有效的外科手术干预治疗，从而达到彻底清除病灶组织、稳定牢固的脊柱内固定支持和充分的病变部位椎体植骨融合[9-10]。

及时而有效的外科手术干预治疗可良好控制脊柱结核病灶在病椎局部及软组织的腐蚀扩散，防止早期出现脊柱后突畸形，甚至防止早期出现瘫痪症状，以及对于已经出现脊柱后突畸形的患者进行脊柱矫正都具有积极的临床意义，但手术干预治疗结束后由于各种原因导致脊柱结核病的复发而需要再次手术甚至多次手术的患者也在逐年增多[11]。

青海省深处我国的内陆，属于青藏高原地区，平均海拔在2500 m左右，大部分地區海拔更高，长期处于高原缺氧环境，这里因交通不便，相对闭塞，导致医疗资源匮乏，卫生条件相对内省较差，且该地区为多种族地区，相互种族之间的语言沟通存在一定障碍，各族生活习惯相差较大等等，从而导致该地区的大部分疾病患者普遍缺乏医疗保健意识，时常延误病情，早期不能发现及治疗，导致肺结核病及脊柱结核病在发病的早期阶段常常没有得到足够的重视，丧失了最佳的治疗机会，大大增加了治疗难度，而且术后该地区此类患者的营养条件普遍欠缺，生活卫生环境较差，种种因素均导致脊柱结核病在术后复发较为常见，且手术治疗后的复发率呈逐渐上升趋势。相关研究已经发现[12-13]由于结核分支杆菌具备顽强的生命力以及具备复杂的免疫机制，极为隐匿，侵蚀范围较广，所以自其被人类研究发现至今一直未能得到及时而有效的控制，尤其是近十几年来结核病蔓延至人体脊柱骨性组织的发病率有所抬头上升，这就使得脊柱结核病在现阶段呈现出死灰复燃的迹象[14-15]。已知人体免疫机制中的CD4+T细胞在抗结核感染细胞免疫中发挥着相当重要的作用[16-17]，在人体内的大多数细胞因子协调作用下初始CD4+T细胞，使其分化为Th17细胞[18]，并且分泌相应的细胞因子（如IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α、IFN-γ、CCL20、CCL22、CCL27、CCR受体及CCL配体等），从而达到促进机体产生炎性反应[19]。endprint

目前，关于在高原缺氧环境条件下IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ对人体内的Th17细胞的调节作用甚为稀少，且关于CCL20、CCL22、CCL27、CCR受体及CCL配体在脊柱结核病复发的研究尚无研究报道。国内外的相关研究发现许多疾病的发生和发展中类似于此类细胞的数量与功能存在着十分密切的关系，并且发挥着巨大的作用[20-21]。过去十几年的国内及国外相关人员研究发现，脊柱结核病和正常未患病对照相比，细胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α含量略为升高[22-23]。

但本研究尚发现在高原缺氧环境条件下复发的脊柱结核感染患者体内的细胞因子IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α的表达较初发组明显增加，而细胞因子IFN-γ的表达较初发组明显降低，考虑这种现象可能与机体长期处于缺氧状态，以及结核分枝杆菌的不断刺激，均导致了体内的效应T细胞在原本正常的细胞增殖活化过程中受到明显抑制，因此通过该项研究可以推测出IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ细胞可作为评估在缺氧环境条件下脊柱结核患者是否存在复发可能性的免疫功能指标。此外，本研究尚监测发现CCL20、CCL22、CCL27在缺氧环境条件下脊柱结核复发患者及初发患者体内含量存在明显的差异性，可考虑将其作为缺氧环境条件下脊柱结核病复发的观察指标。最后，本项研究观察缺氧环境条件下脊柱结核初发组和复发组中CCR4受体变化水平及在CCL配体作用下Th17细胞的趋化指数变化，CCR4受体变化存在差异性，而Th17细胞的趋化指数变化明显，故也可考虑将CCR4受体及CCL配体作为判断缺氧环境下脊柱结核复发的辅助指标。

人体内的Th17细胞及其分泌的细胞因子IL-6、IL-1β、IL-23等通过研究发现可明显提高宿主的抵抗能力[24]，且这些细胞因子均在多种细菌感染中发挥着重要作用[25]。现阶段的国内及国外关于Th17细胞在脊柱结核病中的发挥作用的研究报道稀少[26]，尚存在不少差异，且关于缺氧状态下的报道尚无，有大部分学者通过研究发现Th17细胞的大量表达和脊柱结核病的严重程度呈正比例[27]，也有小部分学者通过研究发现复发性脊柱结核患者体内的Th17细胞的表达受到明显的抑制[28]。本研究发现缺氧环境条件下的复发性结核患者体内的Th17细胞及大多数细胞因子数量显著高于初发性脊柱结核患者，而IFN-γ数量低于初发性脊柱结核患者。所以可以推测缺氧环境下脊柱结核复发性患者机体固有免疫被激活，同时分泌大量细胞因子刺激Th17细胞增殖进而引起一系列免疫病理损伤，与此同时IFN-γ对于抑制Th17 细胞的作用在不断减弱[28-30]。也有相关国外研究报道人体内Th17细胞及分泌的细胞因子IL-6、IL-1β及IL-23并不一定参与了机体抗结核的免疫病理损伤[31]，这可能与人体的免疫应答能力存在一定关联，通过本项研究，我们可以发现在高海拔地区缺氧环境条件下的人体内的CD4+T细胞与脊柱结核病从初发到复发的不同疾病进展阶段具有紧密的相关性，这就说明了人体T细胞免疫应答能力与脊柱结核病的复发具有直接作用[32]。

本研究通过直接检测缺氧环境条件下的脊柱结核病患者的外周血中Th17细胞及细胞因子（IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α、IFN-γ、CCL20、CCL22、CCL27、CCR受体及CCL配体）的含量，反映出了機体的最直接最实际的免疫情况。此外，尚有一些研究人员通过结核特异性抗原刺激后外周血后再检测，也可反应机体免疫应答状况，但该方面的研究尚未明确结论，有待进一步的研究探索。①通过流式细胞术对高原缺氧条件下脊柱结核感染不同病程时期患者外周血中Th17细胞的检测发现，Th17细胞在高原缺氧环境下脊柱结核复发患者中的表达量明显高于初发患者（P < 0.05），提示可将Th17细胞用于结核病及结核复发的诊断、结核病不同病程的区分及患者免疫功能的评估。②通过Luminex技术对结核免疫标志物的检测发现免疫标志物IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α在缺氧条件下脊柱结核复发感染患者中的表达量明显高于脊柱结核初发患者组（P < 0.05），而IFN-γ在缺氧条件下脊柱结核复发感染患者中的表达量低于脊柱结核初发患者组（P < 0.05），提示可将IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α及IFN-γ均作为缺氧条件下脊柱结核复发新的诊断标志物，用于高海拔地区脊柱结核病复发的早期筛查及诊断。③通过ELISA方法对CCL20、CCL22、CCL27进行检测，结果发现复发组CCL20、CCL22、CCL27的浓度明显高于初发组（P < 0.05），从而证实了CCL20、CCL22、CCL27在缺氧状态下对Th17细胞的趋化作用起到了重要的作用。故可考虑将CCL20、CCL22、CCL27作为缺氧环境下脊柱结核复发的指标。④通过免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观察成骨细胞表达CCL20、CCL22、CCL27的细胞形态，结果发现CCL20、CCL22、CCL27在复发组患者的成骨细胞中表达较初发组为高，细胞形态与初发组染色结果相似，经免疫荧光染色鉴定，CCL20、CCL22、CCL27在缺氧环境下脊柱结核复发患者骨组织中明显多于初发组。故可考虑将CCL20、CCL22、CCL27作为缺氧环境下脊柱结核复发的指标。⑤通过软件测试明确了在复发组骨细胞中CCL20、CCL22、CCL27的相对光密度值明显高于初发组。故提示可将CCL20、CCL22、CCL27用于结核病及结核复发的诊断、结核病不同病程的区分及患者免疫功能的评估。⑥通过检测缺氧环境下脊柱结核初发组和复发组中CCR4受体变化水平及在CCL配体作用下Th17细胞的趋化指数变化，CCR4受体变化存在差异性，而Th17细胞的趋化指数变化明显，故也可考虑将CCR4受体及CCL配体作为判断缺氧环境下脊柱结核复发的辅助指标。endprint

綜上所述，人体内的CD4+T细胞的不断分化以及发育对于人体的免疫调节功能和防御能力的平衡具有相当重要的意义，其中部分Th17细胞及其细胞因子（如IL-6、IL-1β、IL-23、TNF-α、CCL20、CCL22、CCL27、CCR受体及CCL配体等）均起到了促进炎症和加强免疫反应的作用，而小部分细胞因子对于Th17细胞的抑制作用也在减弱（如IFN-γ）。本研究通过对多种免疫标志物的同时检测，不仅有效提升了高海拔地区脊柱结核病初发及复发诊断的阳性率，同时将有助于判断脊柱结核病患者在不同病程时期的真实免疫状况，为临床医师对脊柱结核病的筛查诊断以及治疗方案的调整加之患者免疫功能的评估提供了准确的科学依据。

[参考文献]

[1] 徐美霞，吴武中.百白破疫苗接种不良反应原因分析与护理措施[J].中国医药指南，2011，9（36）：434.

[2] Dye C，Scheele S，Dolin P，et al. Consensus statement global burden of tuberculosis： estimated incidence，prevalence，and mortalityby country. WHO global surveillance and monitoring project [J]. JAMA，1999，282（7）：677-686.

[3] 吴启秋，潘毓萱，毕志强，等.骨与关节结核病灶中耐多药结核分枝杆菌对疗效的影响[J].中华骨科杂志，2005， 25（7）：431-433.

[4] Kim SH，Song KH，Choi SJ，et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients [J]. Am J Med，2009，122（2）：189-195.

[5] 李峤珂，吴雪琼，阳幼荣，等.T SPOT-TB 试剂盒在结核病临床诊断中的应用价值[J].实用医学杂志，2010，26（17）：3117-3119.

[6] 张祥英.脊柱结核的外科治疗进展[J].中国矫形外科杂志，2004，12（13）：1025-1027.

[7] Sallusto F，Lanzavecchia A. Heterogeneity of CD4 memory T cells： functional modules for tailored immunity [J]. Eur Immunol，2009，39（8）：2076-2082.

[8] Gu G，Nars M，Hentunen T A，et al. Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro [J]. Cell Tissue Res，2006，323（2）：263-271.

[9] Frost HM. Measurement of human bone formation by means of tetracycline labelling [J]. Can J Biochem Physiol，1963， 355（41）：31-42.

[10] 郑启新，潘海涛，郭晓东，等.一期前路病灶清除植骨内固定治疗胸腰椎结核的疗效[J].中华结核和呼吸杂志，2008，31（2）：99-102.

[11] 周劲松，陈建庭，金大地，等.结核分支杆菌对材料粘附能力的体外实验研究[J].中国脊柱脊髓杂志，2003，13（11）：670-673.

[12] 刘建文，宋应超，李振武，等.肩胛下经胸前路病灶清除减压植骨内固定治疗上胸椎结核并截瘫[J].中国脊柱脊髓杂志，2004，14（12）：757-759.

[13] Bonewald LF， Johnson ML. Osteocytes，mechanosensing and Wnt signaling [J]. Bone，2008，42（4）：606-615.

[14] Anonymous. Diagnostic standards and classi Cation of tuberculosis in adultsand children [J]. Am J Respir Crit Care Med，2000，161（4 Pt 1）：1376-1395.

[15] 谷守山，李永民，王旭，等.钛网及同种异体骨植骨结合内固定治疗脊柱结核： 23 例随访验证[J].中国组织工程研究与临床康复，2010，14（30）：5662-5665.

[16] 朱敏立，蔡伯蔷.慢性阻塞性肺疾病急性加重与肺癌患者的终末期住院费用[J].中华结核和呼吸杂志，2009， 32（4）：258-261.

[17] 王长征.从慢性阻塞性肺疾病的自然病程看早期治疗的重要性[J].中华结核和呼吸杂志，2010，33（7）：557-558.

[18] Chen X，Zhou B，LiM，et al. CD4+CD25+Fox P3+regulatory T cells suppress mycobacterium tuberculosis immunity in patients with active disease [J]. Clin Immunol 2007，123（1）：50-59.

[19] Babu S，Bhat SQ，Kumar NP，et al. Regulatory Tcells modulate Th17 responses in patients with positive tuberculin skin testresults [J]. J Infect Dis，2010，201（1）：20-31.endprint

[20] Tuli SM. Tuberculosis ofthe spine：a historical review [J]. Clin Orthop Relat Res，2007，460（3）：29-38.

[21] 郝定均，郭华，许正伟，等.腰骶段脊柱结核的手术治疗[J].中国脊柱脊髓杂志，2010，20（10）：806-809.

[22] 郭立新，马远征，陈兴，等.脊柱结核的外科治疗与术后疗效评估[J].中华骨科杂志，2008，28（12）：979-982.

[23] Canale ST.坎贝尔骨科手术学[M].10版.卢世璧，王继芳，王岩，译.济南：山东科学技术出版社，2005：1959-1960.

[24] 张卫红，吴启秋，林羽，等.病灶清除术治疗109例脊椎结核失败原因分析[J].中华结核和呼吸杂志，1998，21（3）：181-183.

[25] Harari A，Rozot V，Bellutti Enders F，et al. Dominant TNF-α+Mycobacterium tuberculosis-specific CD4+Tcell responses discriminate between latent infection and active disease [J]. Nat Med，2011，17（3）：372-376.

[26] Guven O，Kumano K，Yalcin S，et al. A single stage posterior approach and rigid fixation for preventing kyphosis in the treatment of spinal tuberculosis [J]. Spine（Phila Pa 1976），1994，19（9）：1039-1043.

[27] Khader SA，Bell GK，Pearl JE，et al. IL-23 and IL-17 in the establishment ofprotective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination andduring Mycobacterium tuberculosis challenge [J] Nat Immunol，2007，8（4）：369-377.

[28] Saenz de Tejada I，Anglin G，KnigIlt JR，et al. Efects of tadalafil Of erectile dysfunction in men with diabetes [J]. Diabetes Care，2002，25（12）：2159-2164.

[29] 刘慧梅，刘加彬，闫家徽，等.胸水γ干扰素释放试验在结核性胸膜炎中的诊断价值[J].中国医药导报，2016， 13（22）：16-19.

[30] 智日增，刘华生，张哲恩，等.结核性胸腔积液中干扰素γ、干扰素α及可溶性程序性死亡配体1的表达及临床意义[J].中国现代医生，2015，53（18）：7-9，14.

[31] Miyahara Y， Odunsi K， Chen W， et al. Generation and regulation of human CD4+ IL-17-producing T cells in ovarian cancer [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（40）：15505-15510.

[32] Li L，Wu CY. CD4+CD25+Treg cells inhibit human memory gamma delta T cells toproduce IFN-gamma in response to M tuberculosis antigen ESAT-6 [J]. Blood，2008，111（12）：5629-5636.

（收稿日期：2017-05-15 本文編辑：苏 畅）endprint