重组人促卵泡激素等电聚焦检测方法研究

汪霖

哈药集团技术中心 黑龙江哈尔滨 150025

重组人促卵泡激素等电聚焦检测方法研究

汪霖

哈药集团技术中心 黑龙江哈尔滨 150025

人促卵泡激素(human follicle stimulating hormone，h FSH)是垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白类促性腺激素[1]。在不孕不育的诊断和治疗中，FSH 起着不可缺少的作用。应用现代生物技术，成功生产出重组人促卵泡激素(rh FSH)。重组人促卵泡激素在临床上使用的优点是蛋白安全、稳定、一致性高，避免了天然 FSH提取过程中出现的糖基化差异[2]。本文则应用GE healthcare多功能水平电泳仪和Invitrogen垂直电泳仪对重组人促卵泡激素进行等电聚焦项目的检测，比较重组人促卵泡激素蛋白在水平与垂直电泳条件下的检测差异，从而建立的一种高分辨率的蛋白质分离分析检测方法。

重组人促卵泡激素；等电聚焦；比较

1.实验材料：

1.1 水平板等电聚焦实验材料

1.1.1 多功能水平电泳仪（GE healthcare，MultiphorⅡ）

1.1.2 等电点标准品（GE healthcare，17-0456-01，等电点范围：pI3 ～10）

1.1.3 两性电解质（GE healthcare，17-0456-01，等电点范围：pI3 ～10）

1.1.4 两性电极条（GE healthcare，18-1004-40）

1.1.5 灌胶支持膜（GE healthcare，80-1129-36）

1.1.6 上样滤纸片（GE healthcare，80-1129-46）

1.1.7 丙烯酰胺(阿拉丁试剂有限公司)

1.1.8 N,N'-甲叉双丙烯酰胺(南京化学试剂有限公司)

1.1.9 十二烷基磺酸钠(广东翁江化学试剂有限公司)

1.1.10 TEMED(Sigma)

1.1.11 甲醇（广东科密欧化学试剂有限公司）

1.1.12 乙醇（广东科密欧化学试剂有限公司）

1.1.13 考马氏亮蓝R-250（上海麦克林生化科技有限公司）

1.1.14 甘油（济宁佰一化工有限公司）

1.1.15 磷酸（天津市致远化学试剂有限公司）

1.1.16 氢氧化钠（天津市致远化学试剂有限公司）

1.1.17 三氯乙酸（济宁泰诺化工有限公司）

1.1.18 过硫酸铵（国药集团化学试剂有限公司）

1.2 水平板等电聚焦溶液配制

1.2.1.10%丙烯酰胺贮液：称取丙烯酰胺10.0g，甲叉双丙烯酰胺0.3g ，加水溶解，定溶至100ml，滤纸过滤备用。

1.2.2 电极液：

1mol/L磷酸溶液（阳极液）：取6.4ml的浓磷酸，加水至100ml，备用

1mol/L氢氧化钠溶液（阴极液）：取氢氧化钠 4g，加水至100ml，备用

1.2.3 50%甘油：取甘油50g,加水混合均匀后定容至 100ml，备用。

1.2.4 固定液（10%TCA）：称取三氯乙酸10g，加水溶解，用水定容至100ml，备用。

1.2.5 脱色液：量取甲醇50ml ，乙酸50ml，加水至500ml，备用。

1.2.6 染色液：称取考马氏亮蓝 R-250 0.1g，加入脱色液100ml，备用。

1.2.7 电泳胶的配制：将GelBondPAG膜亲水面朝内，两侧压上玻璃板，四周用夹子夹住。量取10%丙烯酰胺贮液 2.5ml，两性电解质 0.35ml，50%甘油 0.5ml，水 1.25ml ，10%APS 25µl，TEMED 6µl，注入玻璃板夹层，待凝聚后上样。

1.3 垂直板等电聚焦实验材料

1.3.1 预制胶pH3-7（Invitrogen EC6645Box）

1.3.2 2*样品处理液pH3-7（Invitrogen LC5371）

1.3.3 50倍阳极液（Invitrogen LC5300）

1.3.4 10倍阴极液（Invitrogen LC5370）

1.3.5 等电点标准品（GE healthcare，17-0456-01，等电点范围：pI3 ～10）

1.4 垂直板等电聚焦溶液配制

1.4.1 固定液：称取三氯乙酸 10g，加水溶解，用水定容至100ml，备用。

1.4.2 脱色液：量取甲醇50ml ，乙酸50ml，加水至500ml，备用。

1.4.3 染色液：称取考马氏亮蓝 R-250 0.1g，加入脱色液100ml，备用。

2.操作步骤：

2.1 水平板等电聚焦实验条件：

打开多功能水平电泳仪，5℃条件下预冷，待水平电泳板达到5℃条件下，水平电泳板滴入矿物油，将电极条用配好的阳极电极液及阴极电极液润湿，预电泳30分钟。用纯化水将供试品稀释至蛋白浓度1mg/ml，放置上样滤纸片，每孔上样20μl。用纯化水按100ul/瓶复溶等电点标准品，放置上样滤纸片，每孔上样20μl。5℃条件下，电泳200V，30分钟。

2.2 垂直板等电聚焦实验条件：

首先将预制胶固定于电泳槽中，分别在电泳槽内外加入1×阳极液及1×阴极液。将供试品蛋白浓度浓缩至2mg/ml以上, 1:1的加入2×样品处理液，每孔按照20μg蛋白含量进行上样。用纯化水按100μl/瓶复溶等电点标准品，每孔上样20μl，上样。4℃条件下，电泳100v，1h，电泳时间2.5小时。

2.3 染色脱色：

电泳结束后，即将凝胶放入固定液中固定 30分钟，取出放入平衡液 20分钟，再放入染色液中染色过夜，然后用脱色液浸洗至背影无色，扫描。

3.实验结果

4.实验结论：

我们公司研制的重组人促卵泡激素是利用中国仓鼠卵巢细胞细胞表达的生物分泌性蛋白[3]。重组人促卵泡激素的目的蛋白直接分泌于培养基中，经过一系列的纯化工艺获得的真核细胞表达蛋白，根据蛋白质等电点的差异，当重组人促卵泡激素的净电荷为零时，此时的蛋白pH为其蛋白质的等电点。由电泳对比图所示，rh FSH 的等电点在 3.5～5.2 这一区间之间，与文献报道的PI范围4.0～5.2区间范围基本一致。并且从图中可以直接判断出，垂直板等电聚焦的电泳图，无论是在条带的范围，还是在清晰程度上都优于水平板等电聚焦电泳图的效果。因此，采用垂直板等电聚焦电泳做重组人促卵泡激素等电点效果更好。

[1]张瑞雄 黄雪珍 蔡锦梅;不孕不育症患者血清AMH、LH、FSH、E2检测结果分析[J],海南医学,2016,21.

[2]熊盛,王一飞,钱垂文,罗勇,陈文吟,饶桂荣,粟宽源,余宙耀;抗 HBsAg单链抗体的等电点测定和结构模拟[J],华南理工大学学报,2003,11.

[3]陈宁,重组人促卵泡激素的质量研究[D],吉林大学,2007:66-69.

R473.5

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1672-5018（2017）05-011-01