硫酸去氢表雄酮定量测定试剂盒（化学发光免疫分析法）的研制及性能评价

苏立 贾晨路

硫酸去氢表雄酮定量测定试剂盒（化学发光免疫分析法）的研制及性能评价

苏立★贾晨路

目的研制硫酸去氢表雄酮定量测定试剂盒（化学发光免疫分析法），并对其试剂盒性能进行评价。方法利用竞争抑制法，对原料进行筛选，建立硫酸去氢表雄酮定量测定试剂盒。并分别对本试剂盒的准确性、最低检测限、线性、重复性、特异性、参考范围及样本对比方面进行评价。结果经过筛选，选用反应模式：磁微粒包被羊抗鼠IgG⁃鼠抗硫酸去氢表雄酮单克隆抗体⁃吖啶酯标记DHEAS⁃BSA；对此方法建立的试剂盒进行方法学评价，最低检测限可达1.84μg/dL，线性在0～1 500μg/dL之间，相关系数r=0.999 8，准确度的回收率为105.38%，重复性均小于8%；建立了健康人参考范围（女性：47.9～407.5μg/dL，男性 97.1～522.5μg/dL），与西门子 ADVIA Centaur测定结果显著相关，线性方程为y=1.078 13+0.992 16x，相关系数r=0.994 7，2种试剂盒的测定结果具有较高的一致性。结论本研究建立的硫酸去氢表雄酮定量测定试剂盒（化学发光免疫分析法）各项性能均达到了临床检验的要求，为国产化66硫酸去氢表雄酮定量测定试剂盒（化学发光免疫分析法）的研发奠定了基础，有望用于临床血清硫酸去氢表雄酮的检测。

硫酸去氢表雄酮；化学发光免疫分析法；定量测定试剂盒

去氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA），3β⁃羟基⁃5⁃雄烯⁃17⁃酮，亦称脱氢异雄酮。血清中脱氢表雄酮大部分以硫酸结合物（DHEA⁃S）的形式存在。DHEA⁃S主要来源于肾上腺皮质网状带，具有微弱的雄激素活性，是人体血循环中最为丰富的甾体物质［1］。

女性的DHEA⁃S几乎全部来源于肾上腺皮质，是女性绝经前75%和绝经后100%的雄激素来源。在21～45岁月经正常的育龄女性中，血清DHEA⁃S与年龄呈负相关，可作为评估卵巢储备功能的一项参考指标，为临床诊治提供参考［2⁃3］。而多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）患者血清中的DHEA⁃S与性激素结核球蛋白（sex hormone binding globulin，SHBG）之间存在负相关关系，联合检查对PCOS的诊断具有一定的参考价值［4］。

本研究的目的在于建立一种灵敏度、线性范围、精密度等方面能够与进口厂家试剂盒相近甚至是更好的试剂盒。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG、鼠抗硫酸去氢表雄酮、兔抗硫酸去氢表雄酮、人工抗原DHEAS⁃BSA和吖啶酯均来自苏州亚科科技股份有限公司；硫酸去氢表雄酮企业标准品、质控品由广州市达瑞生物技术股份有限公司制备；伯乐质控品购自 Bio⁃Rad公司。

1.1.2 样本

健康人群血清样本及临床血清样本均来自郑州大学第三附属医院。

1.1.3 仪器

全自动化学发光免疫分析仪，型号：Caris200，来源于厦门优迈科医学仪器有限公司。

1.1.4 耗材

样本杯、反应杯及枪尖均购自厦门优迈科医学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 磁珠包被

磁微粒用 Binding Buffer（0.1 mol/L MES，pH=5）洗涤5次后加入新配置的活化剂活化30min；用Binding Buffer洗涤5次，加入抗体，室温下反应16 h；用含2%BSA的Tris缓冲液洗涤两次，定容后于2～8℃保存。

1.2.2 吖啶酯标记

将0.05 mg吖啶酯加入到0.5 mg DHEAS⁃BSA中，置于摇床上，室温避光反应6 h；然后用葡聚糖凝胶色谱柱分离纯化，流动相为PB（pH=6.3）。纯化后于2～8℃保存。

1.2.3 全自动化学发光免疫分析实验

1.2.3.1 包被羊抗鼠IgG二抗 向反应杯中加入样本50μL、包被羊抗鼠IgG的磁微粒50μL、鼠抗硫酸去氢表雄酮单克隆抗体50μL，在37℃条件下反应14min，再加入按1∶5 000稀释的吖啶酯标记的DHEAS⁃BSA，继续在37℃条件下反应15min。用洗液清洗4遍后将反应杯内洗液全部吸出，加入预激发液 100μL，混合均匀，再加入 100μL 激发液并即刻检测发光值。

1.2.3.2 包被羊抗兔IgG二抗 向反应杯中加入样本50μL、包被羊抗兔IgG的磁微粒50μL、兔抗硫酸去氢表雄酮多克隆抗体50μL，在37℃条件下反应14min，再加入按1∶5 000稀释的吖啶酯标记的DHEAS⁃BSA，继续在37℃条件下反应15min。用洗液清洗4遍后将反应杯内洗液全部吸出，加入预激发液 100μL，混合均匀，再加入 100μL 激发液并即刻检测发光值。

1.2.3.3 包被鼠单抗DHEA⁃S抗体 向反应杯中加入样本50μL、包被鼠抗硫酸去氢表雄酮单克隆抗体的磁微粒50μL，在37℃条件下反应14min，再加入按1∶5 000稀释的吖啶酯标记的DHEAS⁃BSA，继续在37℃条件下反应15min。用洗液清洗4遍后将反应杯内洗液全部吸出，加入预激发液100μL，混合均匀，再加入100μL激发液并即刻检测发光值。

1.2.3.4 包被兔多抗DHEA⁃S抗体 向反应杯中加入样本50μL、包被兔抗硫酸去氢表雄酮多克隆抗体的磁微粒50μL，在37℃条件下反应14min，再加入按1∶5 000稀释的吖啶酯标记的DHEAS⁃BSA，继续在37℃条件下反应15min。用洗液清洗4遍后将反应杯内洗液全部吸出，加入预激发液100μL，混合均匀，再加入 100μL 激发液并即刻检测发光值。

1.2.4 分析性能评价

1.2.4.1 最低检测限 将零浓度校准品进行测定，重复测定20次，计算20次测定结果发光值的平均值（mean，M）和标准差（standard deviation，SD），得出M⁃2SD的发光值，根据零浓度校准品和相邻校准品的浓度⁃发光值的结果进行两点回归拟合得出一次方程，将零浓度校准品的平均值M⁃2SD的发光值代入上述方程中，求出对应的浓度值，即为最低检测限。

1.2.4.2 线性 将浓度接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为5个浓度，其中低值浓度样本需接近线性范围下限。每一浓度样本均重复测试2次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r。

1.2.4.3 准确度 将浓度接近线性范围上限（允许其浓度偏差为±20%）的硫酸去氢表雄酮样品（A）加入到血清或其他相应基质的样品B中，所加入A的体积宜不超过总体积（A+B）的10%，将样品（A+B）重复测试2次并计算其平均值，根据公式（1）计算回收率R。

式中：R⁃回收率；V⁃样品 A 液的体积；V0⁃样品B液的体积；C⁃样品B液加入A液后的检测平均浓度；C0⁃样品B液的检测浓度；Cs⁃样品A液的浓度。

1.2.4.4 重复性 将低、中、高浓度样本各重复检测10次，计算10次测量结果的平均值（M）和标准差（SD），计算公式为：变异系数（variable coeffi⁃cient，CV）CV=SD/M×100%。

1.2.4.5 分析特异性 测定一定浓度的DHEA、皮质醇、醛固酮、雌二醇，各检测2次，并计算其交叉反应率。

1.2.5 参考值范围建立

测定健康人群空腹血清，采用百分位数法建立本试剂盒健康人群空腹硫酸去氢表雄酮参考值范围。

1.2.6 样本比对

西门子公司的硫酸去氢表雄酮测定试剂盒（化学发光法）作为对照试剂，对临床样本进行测定，计算并分析本试剂盒测定结果与西门子对照试剂的相关性及一致性。

1.3 统计学方法

用OrigiPro 7.5对不同反应模式的浓度梯度DHEAS的剂量⁃反应拟合Hill曲线，选择线性关系较好的曲线对应的反应模式。用最小二乘法将零浓度校准品和相邻校准品及梯度浓度样本的测定结果进行计算及分析，得到新建立试剂盒的最低检测限及线性相关系数r。用SPSS 24.0分别将健康男性和健康女性的测定结果进行直方图分析、百分数法和正态分布分析，得到健康男性和健康女性测值的直方图、正态分布曲线及95%置信区间。

2 结果

2.1 反应模式的选择

分别用羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG、鼠抗硫酸去氢表雄酮单克隆抗体、兔抗硫酸去氢表雄酮多克隆抗体包被磁微粒，并用吖啶酯标记DHEAS⁃BSA，以竞争抑制法建立DHEA⁃S的化学发光免疫分析法，检测浓度梯度的DHEA⁃S。将剂量⁃反应拟合Hill曲线，由表1结果可以看出，4个反应模式均显示Hill曲线线性关系较好，其中磁微粒包被羊抗鼠IgG的线性关系为优，R2达到0.993 1。

表1 浓度与发光值的Hill曲线方程Table1 Hill curve equation of concentration and luminescence

2.2 分析性能评价

2.2.1 试剂盒定标与质量控制

试剂定标后分别测量企业质控品及第三方质控品，得到定标结果如图1质控结果如表2所示，两者结果均在质控标示范围内，实验结果准确可靠。

图1 硫酸去氢表雄酮标准曲线Figure 1 Master curve of DHEA⁃S

表2 质控品测量结果Table 2 Measurement results of control

2.2.2 最低检测限

根据零浓度校准品和相邻校准品的浓度⁃发光值的结果进行两点回归拟合得出一次方程，将零浓度校准品的平均值M⁃2SD的发光值代入上述方程中，得到的结果如表3。

表3 最低检测限检测结果（n=20）Table 3 Measurement results of sensitivity（n=20）

2.2.3 线性

用浓度约为1 500μg/dL的高值样本按一定比例稀释为5个浓度，每一浓度样本均重复测试2次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，得到曲线方程为：y=-0.002 15+0.000 7x，线性相关系数r=0.999 8，由此可知试剂在0～1 500μg/dL的测定范围内线性相关性良好（见表4、图2）。

表4 线性检测结果Table 4 Measurement results of linearity

图2 硫酸去氢表雄酮线性拟合Figure 2 Linear fitting of DHEA⁃S

2.2.4 准确度

将浓度接近1 500μg/dL的硫酸去氢表雄酮样品 100μL（A）加入到 900μL 相应基质的样品 B中，将样品A、B和（A+B）重复测试2次并计算其平均值，根据公式（1）计算回收率R，结果见表5。

表5 准确度检测结果Table 5 Measurement results of accuracy

2.2.5 重复性

用浓度分别为（25±5）μg/dL、（150±30）μg/dL和（1 000±200）μg/dL的样本各重复检测10次，计算10次测量结果的平均值（M）和标准差（SD），再计算变异系数（CV），结果显示该试剂重复性良好，见表6。

表6 重复性检验结果（n=10）Table 6 Measurement results of repeatability（n=10）

2.2.6 分析特异性

测定一定浓度的 DHEA（4 000μg/dL）、皮质醇（10 000μg/dL）、醛固酮（5 000μg/dL）、雌二醇（5 000μg/dL），各检测2次，得到测量浓度小于3μg/dL，其交叉反应率小，见表7。

表7 分析特异性Table 7 Result of analytical specificity

2.3 参考值范围建立

本试剂盒对370例健康人血清样本进行检测，其中男性样本177例，女性样本193例，分别用SPSS 24.0软件进行分析，并按照百分数法［5］对测定结果进行分布排序，得到正常人95%置信区间（女性：47.9～407.5μg/dL；男性：97.1～522.5μg/dL），结果如图3、图4所示。

2.4 样本比对

测定218例样本，与西门子公司的硫酸去氢表雄酮测定试剂盒（化学发光法）作测值进行比对，计算并分析本试剂盒测定结果与西门子对照试剂的相关性及一致性。

图3 177例健康男性DHEAS测值直方图Figure 3 Histogram of DHEAS in 177 health male

图4 193健康女性DHEAS测值直方图Figure4 Histogram of DHEAS in 193 health female

2种试剂测定结果线性相关方程为y=1.078 13+0.992 16x（斜率95%置信区间为0.985 15～0.999 17，P＜0.01），相关系数r=0.994 7（图 4），由此可知两者具有良好的相关性。

采用Bland⁃Altmen统计下方法对2种试剂测值进行分析，以2种试剂测值的平均值为横坐标，2种试剂测值的比值为纵坐标，结果显示两者比值的均值为1.01，95%置信区间为（0.79～1.24），其中在95%置信区间外占总样本数的4.13%（9/218）（图5），由此分析2种试剂盒的测定结果一致性较高。

图5 2种试剂样本测值相关性散点图Figure 5 The scatter plot of correlation analysis of 2 assays

图6 2种试剂Bland⁃Altmen分析比对图Figure 6 Bland⁃Altmen Plot assays with 2 reagents

3 讨论

DHEA⁃S的检测在临床上具有重要的意义，而DHEA⁃S的定量测定方法有很多，其中以色谱法最为普遍。2015年Patrick等人［6］用色谱/串联质谱法同时测定10种内源性类固醇激素；2017年Zang等人［7］开发了可以同时测定人血清中9种羟基雄激素及其结合物的方法——液相色谱⁃电喷雾串联质谱法（liquid chromatogra⁃phy⁃mass spectrometry，LC⁃MS）。质谱、色谱等方法具有灵敏度、精密度和准确度高以及特异性好等优点，但由于仪器成本高昂，在普通的临床检验中推广应用成本非常高。为了有效降低检测成本，有研究者通过联合化学发光免疫分析法和LC⁃MS分析不同类型PCOS的雄激素水平，除有力证明血清睾酮、雄烯二酮、DHEA⁃S以及雌激素指数均为诊断PCOS高雄激素血症的敏感指标外，也呈现了化学发光免疫分析法和LC⁃MS对PCOS高雄激素血症的诊断具有一致性这一重要结果［8］。

上述的LC⁃MS和免疫诊断技术配合使用虽有效减少单纯LC⁃MS应用所带来的高成本、耗时长等缺点，但在现代临床检验和生命科学研究中，单纯的免疫诊断技术的使用更为普遍和易于推广。免疫诊断技术的日新月异，使传统的手工操作复杂，反应时间长，对环境污染性强的低端检测技术逐步被新型的化学发光免疫分析技术所取代，化学发光免疫分析具有速度快，结果精确，灵敏度高等优点，通常可测定纳克级或皮克级的化学成分。为肿瘤［9］、糖尿病［10］、性腺分泌异常，甲状腺功能障碍［11］等疾病提供了有力的诊断工具。本研究中建立的试剂盒同样具有化学发光免疫分析的特点，最低检测限可达1.84μg/dL，线性在10～1 500μg/dL之间（西门子、雅培：最低检测限：3μg/dL；线性范围：0～1 500μg/dL），相关系数r=0.999 8，准确度的回收率为105.38%，重复性均小于8%，并且与DHEA、皮质醇、醛固酮、雌二醇交叉反应值小于最低检测限，特异性良好。

市场上硫酸去氢表雄酮的检测以进口试剂盒为主，本文作者对各个进口厂家硫酸去氢表雄酮（化学发光免疫分析法）试剂盒的反应模式进行比较分析，可以看到除了与雅培包被抗DHEA⁃S抗体外，贝克曼包被山羊抗兔IgG二抗，罗氏、西门子2个进口厂家均采用磁珠包被链霉亲和素的反应模式，该模式可以利用链霉亲和素系统的信号放大作用达到更好的灵敏度。本研究在不同的反应模式中比较、选择了与这几个进口厂家不一样的模式，该方法则是利用了二抗的信号放大作用，提高灵敏度，除此之外还可以使得标记和检测更加灵活。

本研究新建立的试剂盒精密度、分析灵敏度和检测范围等性能与进口厂家相比，有很大的竞争优势。为更好地满足临床检测的需要，本文作者未来将对该试剂盒进行覆盖线性范围的大量样本进行检测和比对，并研究该试剂盒的各项稳定性进行验证和评估，有望替代国外昂贵试剂应用于临床检测。

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Development and evaluation of a quantitative assay for dehydroepiandros⁃terone sulfate:chemiluminescence immunoassay

SU Li★，JIA Chenlu
（The Neonatal Disease Screening Center,The Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan，China，450052）

ObjectiveTo develop and evaluate the performance of the Dehydroepiandrosterone sulfate quantitative determination kit:chemiluminescent immunoassay.MethodsThe method of competitive inhibition was used to screen the raw materials and to establish the Dehydroepiandrosterone sulfate quantitative determination kit with chemiluminescent immunoassay.The performance of accuracy,limit of detection,lineari⁃ty,repeatability,analytical specificity,reference interval and samples comparison were determined.ResultsAfter screening,the reaction mode of magnetic particle coated goat anti mouse IgG⁃mouse anti DHEAS antibody⁃acridine ester labeled DHEAS⁃BSA was selected.The limit of detection was less to 1.84μg/dL.This assay was designed to be linear across the measurement range of 0～1 500μg/dL with valuer=0.999 8.The recovery rate was 105.38%.The repeatability was less than 8%.The DHEAS reference interval of healthy population was established(female:47.9～407.5μg/dL,male:97.1～522.5μg/dL).The determination results of serum samples were significantly correlated with results tested by SIEMENS ADVIA Centaur assay with the linear equation was y=1.078 3+0.992 16x and the valuer=0.994 7.The results of these 2 assays showed high consistency.ConclusionAll the performance characteristics of this kit reached the requirements for clinical detection andlaid a foundation for establishing the domestic quantitative assay of dehydroepiandrosterone sulfate,which is able to apply to the clinical detemination of serum DHEA⁃S.

Dehydroepiandrosteronesulfate;Chemiluminescence immunoassay;Quantitative deter⁃mination kit

作者单位：郑州大学第三附属医院新生儿疾病筛查中心，河南，郑州450052

★通讯作者：苏立，E⁃mail：29715562@qq.com