实时荧光定量PCR检测急性髓系白血病miR⁃125b的表达及临床应用

王语欣 杨冬琴 周静东 林江 姚东明 杨静 钱震 杨磊 钱军★

实时荧光定量PCR检测急性髓系白血病miR⁃125b的表达及临床应用

王语欣1杨冬琴1周静东1林江2姚东明2杨静1钱震1杨磊1钱军1★

目的采用实时荧光定量聚合酶链反应（real⁃time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）法检测急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）中微小 RNA⁃125b（microRNA⁃125b，miR⁃125b）转录本含量，初步评价其在AML临床诊断中的意义。方法建立扩增miR⁃125b转录本的SYBR Green I染料法qPCR，对miR⁃125b转录本克隆质粒进行扩增，评价其在AML诊断中的特异性、重复性和灵敏性。并对69例AML患者的骨髓单个核细胞标本进行初步检测并评价其临床相关性。结果该方法能定量检测骨髓标本中miR⁃125b的表达水平，熔解曲线呈单峰，在108～103copies/μL范围内有良好的线性关系（R2=0.999）并且检测重复性良好。结果显示69例AML患者中miR⁃125b表达水平明显高于25例对照组，差异有显著统计学意义（P=0.001）。在初发AML的不同亚型中，M3型的miR⁃125b表达水平高于其他亚型，差异有统计学意义（P＜0.05）。miR⁃125b表达水平与非M3型AML患者的年龄、性别、外周血白细胞计数、血小板计数、血红蛋白含量、FAB分型、核型分组之间均无相关性（P＞0.05）。4例初诊AML患者在获得完全缓解后miR⁃125b表达水平均较治疗前有所降低。结论所建立的实时荧光定量PCR方法能敏感、特异地检测骨髓单个核细胞标本中miR⁃125b的表达水平，为进一步临床应用研究奠定了方法学基础。miR⁃125b异常高表达是AML中的一个常见分子事件，检测其表达可能有助于AML患者的辅助诊断和疾病状态监测。

实时荧光定量PCR；miR⁃125b；急性髓系白血病

急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）是起源于髓系祖细胞的一类造血系统恶性克隆性疾病。其表现为白细胞在骨髓等造血组织中大量增殖，使正常造血功能混乱，导致凶险的感染、出血、器官浸润等，严重危害人类生命健康。微小RNA（microRNA，miRNA）广泛存在于从线虫到人类的多种真核生物中，近年来因发现其参与多种重要生物学过程如调控个体发育、细胞代谢、增殖、分化和凋亡等而备受关注［1⁃2］。miR⁃125b 是miR⁃125家族成员之一，大量研究表明miR⁃125b功能多样，在实体肿瘤中既可起抑癌基因的作用，也可以起促癌基因的作用［3⁃5］，miR⁃125b 在多种血液系统恶性肿瘤中表达异常，在白血病的发生和发展中起到十分重要的作用。比如miR⁃125b在伴有染色体异常的骨髓异常增生综合症、AML和急性淋巴细胞性白血病中异常高表达［6⁃8］；miR⁃125b可通过抑制多种靶基因加速诱导AML发生、发展等［9］。因此，研究结果提示miR⁃125b与白血病发病机制关系密切，具有非常重要的临床意义和应用前景。而寻找一种灵敏度高、操作简便且成本低廉的检测方法是目前miR⁃125b应用于临床研究亟需解决的问题。本研究采用SYBR Green I实时荧光定量 PCR（real⁃time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）技术检测 miR⁃125b在 AML患者骨髓标本中的表达水平，初步探讨miR⁃125b在AML临床诊断和预后判断中的意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

69例AML患者均来自江苏大学附属人民医院接受住院治疗的初诊病例，所有患者诊断分型按照法、美、英分型系统（French⁃American⁃British classification systems，FAB）和 WHO 2008版标准［10⁃11］；其中 AML 正常核型 24 例、AML 伴t（8；21）6例、AML伴t（15；17）14例、AML伴+8染色体异常3例、AML伴⁃5/5q⁃染色体异常1例、AML伴复杂核型9例、其他核型类型9例、无资料3例。FAB分型中M1型5例、M2型27例、M3型14例、M4型15例、M5型8例。对照组25例为非恶性血液病患者（缺铁性贫血及免疫性血小板减少性紫癜）。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象均已签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 骨髓单个核细胞（bone marrow mononucle⁃ar cells，BMMNCs）的分离、RNA提取和逆转录

全部患者均于初诊时抽取骨髓10 mL，肝素抗凝，用Ficoll密度梯度离心法分离BMMNCs，应用mirVana miRNA试剂盒提取总RNA（Ambion，美国），经紫外分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度，-80℃保存备用。逆转录总体系共20μL，含蒸馏水 14μL、缓冲液 4μL、RNA 1μL、逆转录酶 1μL（MiScript Reverse Transcription Kit，Qiagen公司，catalog no.218061）。反应条件为：① 37℃1 h，②95℃5min，随后4℃保持。

1.2.2 qPCR

引物设计采用Primer Premier 5.0软件，miR⁃125b 引物序列上游为 5′⁃CCCTGAGACCCTA⁃ACTTGTG⁃3′，下游引物为miRNA通用下游引物。U6作为内参管家基因，其上游引物为5′⁃GT⁃GCTCCCTGCTTCGGCAGCACATATAC⁃3′，下游引物为 5′⁃AAAAATATGGAACGCTTCACGAAT TTG⁃3′，引物由上海华大基因科技有限公司合成。反应在ABI 7500扩增仪（ABI，美国）上进行，扩增条件为94℃预变性15min，94℃变性15 s、55℃退火30 s、70℃延伸30 s，共40个循环，熔解曲线程序为 95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s、60℃ 15 s。选取miR⁃125b与U6表达ΔCT值最小的1例对照标本作为对照。miR⁃125b表达采用如下公式：NmiR ⁃125b=（EmiR ⁃125b）△ CTmiR ⁃125b（control⁃sample）÷（EU6）△CTU6（control⁃sample），PCR 扩增效率 E=10（⁃1/slope）；ΔCT指对照与标本之间miR⁃125b和U6循环阈值（CT）值的差异。

1.2.3 标准曲线的制作

重组miR⁃125b质粒作为阳性模板：用凝胶回收试剂盒（Axygen，美国）将扩增产物纯化回收，miR⁃125b全序列与pMD®19⁃T克隆载体（Takara，日本）连接过夜重组载体，随后重组质粒转化，通过质粒DNA小量试剂盒（Axygen，美国）提取质粒，测序鉴定（上海华大基因科技有限公司）；从108copies/μL开始进行10倍稀释，建立阳性模板梯度，进行qPCR扩增检测。扩增后根据扩增曲线设定统一阈值，然后根据其浓度及各浓度对应的Ct平均值绘制标准曲线。

1.2.4 统计学分析

应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，分类变量之间的差异统计采用卡方检验或Fisher确切概率法；连续性变量之间的差异统计使用Kruskal⁃Wallis（多组间比较）或Mann⁃WhitneyU检验（两组间比较）。miR⁃125b表达在AML中的诊断价值采用接收者操作特征曲线（receiver operating charac⁃teristic，ROC）及曲线下面积（area under the ROC curve，AUC）进行评价；所有分析均设定P值为双侧分布，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 qPCR法的灵敏度、重复性、特异性和扩增效率

检测miR⁃125b阳性模板的扩增曲线S型（图1）。解离曲线分析显示扩增产物为单一熔解峰。在 108～103copies/μL 的范围内 Ct值和不同浓度miR⁃125b质粒呈良好线性关系，标准曲线相关度（R2）为 0.999，标准曲线的斜率（slope）为-3.422。制作成标准曲，重复性良好（图1）。同样，U6质粒阳性模板标准曲线重复性良好，R2=0.998，slope=-3.298。对不同浓度miR⁃125b质粒和U6质粒分别扩增6次，在108～103copies/μL的范围内重复性良好（表1）。

图1 不同浓度miR⁃125b重组质粒qPCR荧光扩增结果及其标准曲线Figure 1 Fluorescence amplification and standard curve of recombinant miR⁃125b plasmid in different concentrations

表1 不同浓度miR⁃125b和U6基因扩增6次的变异系数Table l Coefficient of variation of amplification of 6 times on different concentrations of miR⁃125b andU6genes

2.2 qPCR法检测AML患者中miR⁃125b的表达情况

25例对照组和69例AML患者标本均可见扩增曲线，但表达程度不同（图2）。25例对照的NmiR⁃125b为0.03%～100%（中位0.68%），AML患者标本的 NmiR⁃125b为 0.03%～6983.49%（中位 5.12%）。与对照组相比，AML患者miR⁃125b表达水平较对照组显著上调（P=0.001）。进一步分析miR⁃125b在FAB分型中不同亚型的表达水平差异，发现miR⁃125b在各个亚型中的表达水平均高于对照组，而其中miR⁃125b在M3型中表达水平最高且差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

图2 部分AML患者及对照组骨髓标本中miR⁃125b荧光定量PCR扩增曲线Figure 2 PCR amplification curve of miR⁃125b in part of bone marrow of AML patients and controls

2.3 miR⁃125b表达的鉴别诊断意义

应用ROC曲线评估miR⁃125b可否作为AML患者辅助诊断的一个潜在标记。结果显示miR⁃125b表达水平可作为鉴别对照组与研究组的参考标志（AUC=0.723，95%置信区间为0.619～0.827，P=0.001）。在 miR⁃125b 表达水平为 4.7%时，诊断AML的敏感性和特异性分别为53%和92%（图4）。

图4 miR⁃125b表达水平辅助诊断AML的ROC曲线Figure 4 ROC curve analysis through using miR⁃125b for discriminating AML patients

2.4 miR⁃125b的表达与临床参数相关性

本研究以ROC曲线cut⁃off值为界将总体AML患者分为miR⁃125b低表达组与高表达组。miR⁃125b高表达组与低表达组的性别、年龄、血小板计数差异均无统计学意义（P＞0.05），而miR⁃125b高表达组的患者外周血白细胞计数、血红蛋白量与原始细胞计数低于miR⁃125b低表达组（P＜0.05）。miR⁃125b高、低表达组间的FAB分型、不同核型以及染色体危险程度分型比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。其中，在M1⁃M5不同亚型中，M3亚型中miR⁃125b高表达的频率显著高于其他亚型分组［93%（13/14）与44%（24/55），P＜0.001］。在非M3型AML患者中，结果显示miR⁃125b基因的表达水平与年龄、性别、血红蛋白量、外周血白细胞计数、血小板计数、染色体分组等均无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 总AML患者与非M3AML患者中miR⁃125b表达水平与临床资料分析Table 2 Comparison of clinical characteristics of miR⁃125b expression between whole AML and non⁃M3 patients

2.5 miR⁃125b表达在AML随访中的意义

对miR⁃125b表达水平较高的4例初诊AML患者的骨髓标本进行治疗前后的检测，结果显示，患者病情获得完全缓解后的miR⁃125b表达水平较治疗前均明显下降（图5）。

图5 4例AML患者治疗前后miR⁃125b表达的变化Figure 5 The levels of miR⁃125b expression of 4 patients in the AML patients before and after complete remission

3 讨论

miRNAs转录后的调节功能影响着机体各种重要的生理和病理活动过程，其表达变化通常与各种疾病的发生发展密切相关。已有研究报道miR⁃125b参与白血病的发生发展，在伴有染色体异常和基因突变的AML中表达增高且其表达水平与疾病状态有关［12⁃13］。这些重要研究提示miR⁃125b可能有助于今后AML的诊断与病情监测。

要将miRNAs作为疾病诊断的生物学标志物，需要建立标准而规范的提取方法和检测方法。随着miRNAs在肿瘤发生发展中的重要性被逐渐重视，miRNAs的检测技术也取得了快速发展，主要包括有传统的表达文库克隆、Northern blot和逆转录聚合酶链反应（reverse transcription PCR，RT⁃PCR），还包括基因芯片技术、高通量测序等新型技术。其中RT⁃PCR以其特异性强、灵敏度高、快速便捷、价格低廉等优点，被认为是目前定量检测miRNAs的金标准［14⁃15］。本研究运用 SYBR Green I染料标记技术建立的一种qPCR方法对骨髓标本中miR⁃125b进行定量检测。该方法无需设计探针，引物设计相对容易，操作简便，成本低廉，适用于推广应用［16］。本研究结果表明SYBR Green I qPCR检测miR⁃125b方法具有良好的特异性、重复性和灵敏性。本文采用相对定量法，可用于检测骨髓标本中miR⁃125b的表达水平。数据分析显示，69例AML患者中miR⁃125b表达水平高于对照组（P=0.001）。同时在AML不同亚型中miR⁃125b表达水平存在差异，其中M3型miR⁃125b表达水平远高于其他亚型，提示miR⁃125b异常高表达与急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）密切相关。这与 Zhang［17⁃18］、Li等［19］的研究结果一致。有报道称，miR⁃125b可以干扰人类CD34+细胞分化，抑制白血病细胞NB4和HL60向末端（粒系和单核系）分化，揭示了miR⁃125b在APL抑制分化功能［6］。在非M3型AML患者中，miR⁃125b高低表达组与AML亚型、血液学参数和完全缓解率均无相关性（P＞0.05）。ROC曲线分析表明miR⁃125b表达对于AML具有中等诊断价值。

同时，我们对4例AML患者进行了监测，发现缓解后miR⁃125b表达水平较治疗前明显下降，提示miR⁃125b表达可能作为一个分子标志用于疾病状态的监测。但同时本研究病例数较少，ROC曲线分析显示敏感性和特异性不高，因此用miR⁃125b诊断、鉴别诊断及评价疾病的预后仍需进一步研究。

综上所述，本研究建立的SYBR Green I qPCR检测miR⁃125b是一种简便、可靠、准确、快速的高通量定量检测方法，易于临床实验室推广应用，有助于大样本的临床研究。miR⁃125b异常高表达是AML中的一个常见分子事件，检测其表达可能有助于AML患者的辅助诊断和疾病状态监测。

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Detection and clinical application of miR⁃125b in acute myeloid leukemia by real⁃time fluorescence quantitative PCR

WANG Yuxin1，YANG Dongqin1，ZHOU Jingdong1，LIN Jiang2，YAO Dongming2，YANG Jing1，QIAN Zhen1，YANG Lei1，QIAN Jun1★
（1.Department of Hematology，Affiliated People's Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu，China，212002；2.Laboratory Center，Affiliated People's Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu，China，212002）

ObjectiveTo evaluate the method of real⁃time quantitative polymerase chain reaction(qPCR)for detecting miR⁃125b transcript in patients with acute myeloid leukemia(AML)and further investigate the characteristics and clinical implication of miR⁃125b in AML.MethodsThe reaction system and reaction condition of qPCR with SYBR Green I was established to detect the expression of miR⁃125b to evaluate its specificity,repeatability and sensitivity in AML diagnosis.Afterwards,the samples of bone marrow mononuclear cells from 69 AML patients were evaluated.ResultsThe method can detect the expressionlevel of miR⁃125b in AML patients.The melting curve showed a single peak,the PCR products was specific,a good linear relationship in the range of 108copies/μL to 103copies/μL(R2=0.999),and the detection was repeatable.The expression level of miR⁃125b in 69 AML patients was significantly higher than those in 25 controls(P=0.001).In different subtypes of AML,the expression level of miR⁃125b in M3 was higher than that in other subtypes,and the difference was statistically significant(P＜0.05).There was no correlation between the expression ofmiR⁃125b and the age,gender,peripheralblood leucocytecounts,plateletcount,hemoglobincontent,FAB classifications and karyotypes(P＞0.05)in non⁃M3 AML patients.The levels of miR⁃125b expression of 4 patients in the observation group decreased after complete remission.ConclusionsThe SYBR Green I qPCR for miR⁃125b was a sensitive,reliable quantitative assay,and it can be used in the diagnosis of AML and the disease therapy evaluation.The increased⁃expression of miR⁃125b may be a common molecular event in AML,and detecting its expression level could be used for auxiliary diagnosis and monitoring disease.

Real⁃time quantitative PCR;miR⁃125b;Acute myeloid leukemia

作者单位：1.江苏大学附属人民医院血液科，江苏，镇江212002
2.江苏大学附属人民医院中心实验室，江苏，镇江212002

国家自然基金项目（81270630）；江苏省六大人才峰会项目（2015⁃WSN⁃115）；镇江市社会发展项目（SH2015058）；江苏大学临床医学科学发展基金会项目(JLY20140018)

★通讯作者：钱军，E⁃mail：qianjun0007@hotmail.com