抗须癣毛癣菌细胞壁蛋白的卵黄抗体制备和鉴定

胡青青 赵肃清 贺 攀 焦洛莹

(广东工业大学轻工化工学院,广州510006)

抗须癣毛癣菌细胞壁蛋白的卵黄抗体制备和鉴定

胡青青 赵肃清 贺 攀 焦洛莹

(广东工业大学轻工化工学院,广州510006)

目的：提取须癣毛癣菌的细胞壁蛋白作为免疫原制备特异性卵黄抗体，并鉴定其生物活性,为卵黄抗体在预防与治疗皮肤癣疾病的应用奠定基础。方法：本研究采用冷碱抽提的方法提取须癣毛癣菌的细胞壁蛋白，并用其免疫健康的产蛋母鸡。采用聚乙二醇两步沉淀法及饱和硫酸铵盐析提纯卵黄抗体；用Bradford法检测卵黄抗体中蛋白含量；SDS-PAGE凝胶电泳分析测定卵黄抗体的纯度以及相对分子质量；ELISA检测纯化的卵黄抗体的效价；Western blot分析特异性卵黄抗体的免疫反应性。结果：提取的卵黄抗体中蛋白纯度达到87.27%。由细胞壁蛋白制备的特异性卵黄抗体在初免20 d后效价开始升高，到45天达到最高值(1∶32 000)。Western blot结果显示由细胞壁蛋白制备的卵黄抗体能与其良好的特异性结合，具有较好的免疫反应性。结论：本实验提取的须癣毛癣菌细胞壁蛋白作为免疫原可以制备出特异性较强的卵黄抗体，为须癣毛癣菌感染的皮肤疾病提供了治疗新思路。

须癣毛癣菌；细胞壁蛋白；卵黄抗体

须癣毛癣菌是引起皮肤癣疾病的主要病原之一，是一类侵犯人体角蛋白组织的丝状真菌[1,2]，能感染人体皮肤、指(趾)甲和毛发等而引起皮肤癣菌病，还可以引起脓癣、脓肿和肉芽肿等皮肤深部感染。目前，针对由皮肤癣菌引起的疾病主要通过抗真菌的药物、激光等进行治疗[3-6]。市面上治疗皮肤癣类疾病的药物主要有酮康唑、氟康唑和伊曲康唑等。此外，还有一些植物的精油提取物[7,8]。然而，随着真菌感染率的不断升高,现有抗真菌药物耐药性日趋严重，并且治疗周期长，见效慢，病情的反复性，给个人、家庭甚至社会都带来沉重的负担。因此，研发出安全、高效的抗菌制剂以解决紧迫的市场需要变得更为迫切。

近年来，由于卵黄抗体生产工艺简单、经济安全，利用细菌、真菌、病毒作为免疫原制备卵黄抗体成为一个热门[9]。朱思思等[10]制备了抗肠道病毒71型特异性卵黄抗体，为进一步研发含有抗EV71 IgY的预防治疗产品提供了前期工作。胥亚夫等[11]以3种主要的腐败菌腐败希瓦氏菌、荧光假单胞菌和腐臭假单胞菌作为混合抗原制备了卵黄抗体，这种卵黄抗体对于这三种细菌均有抑制作用。Ibrahim等[12]的研究表明抗白色念珠菌的卵黄抗体不仅能够体外抑制白色念珠菌对宿主细胞的吸附作用，在体内也能够有效地治疗小鼠的口腔感染。

本文提取了须癣毛癣菌的细胞壁蛋白作为免疫原，制备特异性卵黄抗体。利用ELISA、SDS-PAGE凝胶电泳和免疫印迹实验检测卵黄抗体的生物活性。根据SDS-PAGE和Western blot结果，卵黄抗体与提取的须癣毛癣菌细胞壁蛋白特异性结合。抗tmCWP的IgY的制备为由其感染的皮肤癣疾病的预防和治疗方案的研发提供了基础性研究。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验菌株 须癣毛癣菌(GIM 3.598)由中山大学第三附属医院皮肤科提供。

1.1.2实验动物 广州太和良田养鸡场健康产蛋母鸡4只，未经任何免疫，正常饲养。

1.1.3主要培养基 沙氏琼脂培养基，沙氏液体培养基。

1.1.4主要试剂和仪器 弗氏佐剂(Freund′s adjuvant)购自Sigma公司；HRP标记山羊抗鸡 IgY二抗购自Promega公司；PEG6000为日产购自广东国奥生物科技公司；BSA购自上海博奥生物科技公司；考马斯亮蓝G250购自中国医药上海化学试剂有限公司，ECL发光液(Millipore,America)；其他试剂为国产分析纯。酶标分析仪Tecaninfinite 200(Tecan,Switzerland)；真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)；高速冷冻离心Allegra TM64R Centrifuge(Beckman,America)。

1.2实验方法

1.2.1真菌的培养 将须癣毛癣菌划线接种到沙氏琼脂培养基斜面，放置生化培养箱中培养6 d(28℃)。用无菌的PBS冲洗孢子，转入到沙氏液体培养基中，置于摇床培养5 d(28℃，160 r/min)。离心得到菌丝，用无菌的PBS反复冲洗，得到的沉淀冷冻干燥，放置-20℃保存。

1.2.2细胞壁蛋白的提取 须癣毛癣菌的细胞壁蛋白的提取方法参照张成省等[13]的冷碱抽提的方法并加以改进。冻干的菌丝加入液氮反复研磨，加入适量的PBS溶解，加入200 μl的10 mmol/L PMSF，在冰浴中利用超声细胞破碎仪充分破碎细胞，工作2 s，间隔5 s，处理300次。离心10 min(4℃，6 000 r/min)后得到沉淀，并用蒸馏水反复冲洗、离心，沉淀即为须癣毛癣菌的细胞壁组分。随后，加入0.1 mol/L预冷的氢氧化钠溶液，混合搅拌24 h，离心20 min(4℃，10 000 r/min)，得到上层清夜。用1 mol/L盐酸中和至7 d，用1×PBS缓冲液(pH 7.2)透析3 d，透析液即为细胞壁蛋白。利用BCA试剂盒测定提取的蛋白浓度，并用PBS稀释至 1 mg/ml。

1.2.3免疫方法 取1 mg/ml的蛋白溶液与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后，经肌肉多点注射实验母鸡，每只500 μl；间隔14 d进行加强免疫，加强免疫采用弗氏不完全佐剂与蛋白溶液等体积混合乳化，共加强免疫4次。第二次免疫后收集鸡蛋，连续收集3个月，按照天数进行编号，取未免疫的鸡蛋作为阴性对照。

1.2.4卵黄抗体的提纯 将收集的鸡蛋用75%的酒精浸泡消毒，破壳去除蛋清和蛋黄膜，收集卵黄液。采用PEG两步沉淀的方法提取卵黄抗体[14]:加入卵黄液3倍体积的3.5%的PEG6000的PBS溶液，调节pH至7.2，搅拌40 min后，4℃静置过夜。离心20 min(4℃，10 000 r/min)后取上清液，用4层纱布过滤,并缓慢加入固体PEG6000使最终浓度为12%，调pH至7.2，搅拌30 min。离心20 min(4℃，10 000 r/min)，弃上清得沉淀，即为IgY粗品。 沉淀用少量4℃ PBS(1 mol/L，pH7.2)溶解后，离心10 min(4℃，10 000 r/min)，取上层清液，缓慢滴加与滤液等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃静置过夜。离心10 min(4℃，10 000 r/min)，得到沉淀，用少量的PBS缓冲液(pH7.2)溶解，再加入1/2体积的饱和硫酸铵溶液，4℃静置2 h。离心20 min(4℃，10 000 r/min)，得到沉淀物。再用少量的PBS溶解，转入透析袋，透析3 d，收集透析液，在-60℃下真空冷冻干燥12 h，冻干粉放于-20℃保存。

1.2.5卵黄抗体的蛋白含量测定 采用Bradford法检测卵黄抗体冻干粉中的蛋白含量。

1.2.6SDS-PAGE电泳 采用变性SDS-PAGE凝胶电泳(4%浓缩胶、12%分离胶)检测提取的细胞壁蛋白；卵黄抗体粗品与纯品的检测采用4%浓缩胶，10%分离胶。

1.2.7间接ELISA法检测卵黄抗体的效价 将须癣毛癣菌菌悬液用0.01 mol/L PBS 调至浓度为1.2×108CFU/ml，包被于96孔酶标板上(100 μl/孔)，37℃温浴2 h后，放置4℃过夜，用PBST洗涤3次，拍干。加入含3%脱脂奶粉的PBS作为封闭液(200 μl/孔)，37℃温浴1 h后，倒出，用PBST洗涤3次，拍干。卵黄抗体用0.01 mol/L PBS倍比系列稀释后加入96孔酶标板(100 μl/孔)，37℃温浴1 h后用PBST洗涤3次，拍干。加入1∶5 000稀释后的酶标二抗HRP-GAM IgY(100 μl/孔)，37℃温浴 1 h，用PBST洗涤3次，拍干。加入TMB显色液(100 μl/孔)放置37℃水浴15 min，2 mol/L H2SO4溶液终止反应(50 μl/孔)，立即用酶标仪测定OD=450 nm处的吸光值。以未免疫鸡阴性IgY作为阴性对照，阳性孔值OD值≥阴性孔OD值的2.1倍的最高稀释倍数为卵黄抗体的效价，且阴性IgY吸光值大于0.1作为抗体阳性的判定阀值。

1.2.8免疫印迹(Western blot) 将SDS-PAGE凝胶电泳分离的细胞壁蛋白条带转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉作为封闭液，室温封闭2 h，用TBST洗涤3次，每次15 min。卵黄抗体用0.01 mol/L PBS稀释50倍，4℃孵育过夜，用TBST洗涤3次，HRP标记山羊抗鸡IgY 作为二抗，稀释1∶5 000，孵育2 h，用TBST洗涤3次。最后滴加ECL发光液置于暗室曝光。

2 结果

2.1蛋白浓度的测定 采用BCA蛋白含量测定试剂盒检测细胞壁的蛋白浓度为1.312 4 mg/ml。Bradford法标准曲线(图1)，得到的蛋白浓度计算公式为：y=0.006 4x+0.020 9,R2=0.991 5。由卵黄抗体的OD平均值为0.579 4可以算出，用须癣毛癣菌细胞壁蛋白制备的卵黄抗体的蛋白浓度为87.27 μg/ml，其蛋白纯度为87.27%。

2.2SDS-PAGE凝胶电泳 须癣毛癣菌细胞壁蛋白的SDS-PAGE电泳图表明(图2)采用冷碱抽提的方法提取得到的主要蛋白条带有7条，分子量约在34～130 kD的范围内。由卵黄抗体的SDS-PAGE电泳结果(图3)可见抗tmCWP的特异性IgY 在加热情况下二硫键被还原打开，裂解成分子量约为70 KD的重链和25 kD的轻链。由PEG两步沉淀法提取的卵黄抗体在90 kD，28～35 kD存在一些杂蛋白，经过饱和硫酸铵溶液纯化后的卵黄抗体纯度明显提高。

2.3ELISA 检测IgY效价 用ELISA检测抗tmCWP的IgY抗体效价及其消长规律(图4)。初免后约20 d卵黄中特异性抗体效价逐渐增长，加强免疫后，效价呈明显的增长趋势。当初免后40 d卵黄抗体的效价达到了最高值1∶32 000，并且最高效价持续时间为40 d左右，初免后80 d，卵黄抗体的效价开始下降，95 d后效价降到最低。

2.4Western blot结果 抗tmCWP特异性IgY采用PEG两步沉淀法和饱和硫酸铵法进行提取和纯化，并且对纯化后的IgY用Western blot进一步鉴定，证明其能与提取的tmCWP发生特异性结合。在130、95、68、62、47、38和34 kD处均有特异性结合，与此相反，阴性IgY则对tmCWP没有任何反应(图5)。分子量为47 kD的蛋白可能为须癣毛癣菌的烯醇化酶，其余的蛋白可能为以共价键与糖类连接的结构蛋白，也可能为壳多糖合成酶、甘露糖转移酶和1,3-β葡聚糖合成酶的催化亚单位等参与细胞壁合成的关键酶，这与文献相符[15,16]。由此说明，所制备的抗tmCWP的IgY具有良好的抗tmCWP特异性。

图1 BSA蛋白标准曲线图Fig.1 Standard curve of BSA

图2 须癣毛癣菌细胞壁蛋白的SDS-PAGE电泳Fig.2 SDS-PAGE of tmCWPNote: 1 .Protein marker;2 .The tmCWP.

图3 抗tmCWP特异性IgY的SDS-PAGE电泳分析Fig.3 SDS-PAGE pattern of anti-tmCWP special IgYNote: 1 .Protein marker;2.IgY extracted by PEG6000;3.IgY purified by saturated ammonium sulfate.

图4 抗tmCWP的IgY抗体效价消长规律Fig.4 Development pattern of anti-tmCWP IgY

3 讨论

采用液氮研磨和超声细胞破碎仪破壁，得到的细胞壁纯度较高，由胞质所引起的实验误差降低[13]。由于真菌的细胞壁上存在大量多糖，影响细胞壁上蛋白质的提取，本文采用冷碱抽提的方法提取细胞壁蛋白，预冷后的氢氧化钠能够有效地提取细胞壁上的蛋白组分，并且减少细胞壁上多糖的影响。提取的低温环境能够降低提取蛋白的降解及变性。另外，采用透析的方法减少提取蛋白中小离子杂质。

本实验采用PEG两步沉淀法提取卵黄抗体是比较常规的方法。制备周期短，操作简单，便于实验室大量提取卵黄抗体。相比直接加入硫酸铵固体的方法，采用饱和硫酸铵溶液滴加方法能够减少因局部浓度过大导致的蛋白质变性。得到的卵黄抗体中蛋白含量达到87.27%。

须癣毛癣菌的细胞壁主要是由β-(1,3)-葡聚糖、甘露糖蛋白、壳多糖等成分组成，参与细胞壁合成途径的各类酶是理想的作用靶点。烯醇化酶是位于真菌胞外的细胞壁表面的管家蛋白[17]，可能是引起人类真菌感染的主要变应原并增强了真菌的毒力效应。以须癣毛癣菌细胞壁蛋白作为免疫原，通过免疫母鸡获得抗tmCWP的特异性卵黄抗体，采用ELISA检测其效价达到1∶32 000。通过对比蛋白电泳图和免疫印迹试验结果，抗原抗体在分子量34～130 kD范围内对应处均有特异性结合。本研究中提取的蛋白成分可能为须癣毛癣菌细胞壁的糖蛋白、合成酶以及烯醇化酶等。

图5 免疫印迹分析Fig.5 Western blot analysisNote: 1 .Protein marker;2.Anti-tmCWP IgY;3.IgY combine with HRP affinipure rabbit anti-chicken IgY;4.Non-immunizated IgY.

皮肤癣真菌感染的第一步是黏附皮肤表皮细胞，然后出芽、产生菌丝入侵角质层。皮肤癣菌与宿主细胞表面产生的特异性识别可能是通过真菌细胞壁蛋白与宿主细胞表面的碳水化合物结合[18]。IgY预防疾病的作用机理是通过特异性抗原抗体的结合，减少真菌对于宿主细胞的黏附，从而对宿主产生保护作用[19]。因此，本研究主要制备了抗tmCWP的特异性IgY，为研发治疗须癣毛癣菌导致的皮肤癣疾病的药物提供了基础。可进一步研究其体外抑菌活性，建立感染须癣毛癣菌的豚鼠模型，检测卵黄抗体的治疗效果。具有抑菌效果的特异性卵黄抗体可作为产品添加剂，促进其预防与治疗效果。

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[收稿2017-03-02 修回2017-03-22]

(编辑 许四平 刘格格)

PreparationandidentificationofspecificchickeneggyolkimmunoglobulinsagainstcellwallproteinofTrichophytonmentagrophytes

HUQing-Qing,ZHAOSu-Qing,HEPan,JIAOLuo-Ying.

SchoolofChemicalEngineeringandLightIndustry,GuangdongUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China

Objective:Prepared the specific chicken egg yolk immunoglobulins (IgY) against the cell wall protein of Trichophyton mentagrophytes (tmCWP) and detected its biological activities,which was to establish the basis for the preventment and treatment in dermatophytes disease.Methods: In this work,tmCWP was extracted and purified by cold alkali method,and being used as immunogen to immunized healthy laying hens.The IgY was extracted from the egg yolk by polyethylene glycol method and purified by saturated ammonium sulfate method,respectively.The concentration of the extracted IgY was detected by Bradford method.The purity and molecular weight of the specific anti-tmCWP IgY were analysed by SDS-PAGE.The titer of IgY was obtained by ELISA.The immunoreactivity of IgY was performed by Western blot.Results: The purity of the extracted IgY reached to 87.27%.ELISA indicated that the titer of the specific anti-tmCWP IgY gradual rised 20 days after primary immunization and reached to the highest value (1∶32 000) after 45 days.Western blot revealed that the specific IgY showed a good immunoreactivity and a specifically combination capacity.Conclusion: In our work,the tmCWP could be regarded as the immunogen to prepare the specific anti-tmCWP IgY,which could provide a novel thought for the therapy of Trichophyton mentagrophytes infection.

Trichophyton mentagrophytes;Cell wall protein;IgY

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.015

胡青青(1989年-)，女，在读硕士，主要从事抗皮肤癣菌卵黄抗体的制备及性能研究，E-mail：hqq2218@126.com。

及指导教师：赵肃清(1969年-)，男，博士，博士生导师，主要从事免疫学方面的研究，E-mail:sqzhao@gdut.edu.cn。

R318

A

1000-484X(2017)09-1350-05