5-烯去甲斑蝥酸喜树碱20-位酯衍生物的合成及其抗肿瘤活性研究

赵长阔，王先恒,2，高 磊，杨福红，保玉娇，李 婵

(1.遵义医学院 药学院药物化学教研室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 药学院临床药学教研室，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

5-烯去甲斑蝥酸喜树碱20-位酯衍生物的合成及其抗肿瘤活性研究

赵长阔1，王先恒1,2，高 磊1，杨福红1，保玉娇1，李 婵1

(1.遵义医学院 药学院药物化学教研室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 药学院临床药学教研室，贵州 遵义 563099)

目的为增强喜树碱的抗肿瘤活性，设计并合成型5-烯去甲斑蝥酸喜树碱20-位酯衍生物。方法顺丁烯二酸酐与呋喃在乙醚中通过[4+2]环加成反应得到5-烯去甲斑蝥素1，1醇解得到5-烯去甲斑蝥素单酸甲酯的侧链2；侧链2与喜树碱在耦合剂及有机碱催化剂存在下，酯化得到5-烯去甲斑蝥酸喜树碱20-位酯衍生物3；采用CCK-8法考察了3对4种肿瘤细胞株的体外抑制活性。结果5-烯去甲斑蝥酸喜树碱20-位酯衍生物3通过喜树碱和5-烯去甲斑蝥素单酸甲酯偶联合成，收率达89%，其对于胃癌BGC803和胰腺癌PANC-1细胞的抑制率高达70%，活性与斑蝥素及喜树碱2个阳性对照药品相当，而对于肝癌HepG2和结肠癌SW480的抑制率分别为67%和55%。结论5-烯去甲斑蝥酸喜树碱20-位酯衍生物3对测试4种肿瘤细胞具有较好的抑制活性。

喜树碱；5-烯去甲斑蝥酸；合成；CCK-8法；抗肿瘤活性

喜树是我国特有物种，属于蓝果树科喜树属植物，主要分布于长江流域以及西南各省区[1]。贵州是喜树的主产区之一，在全省各县均有分布，包括野生及人工栽培[2]。喜树碱(Camptothecin，CPT)是一种存在于喜树叶子、果实，具有良好抗癌活性，较为广泛的天然产物，对于胃肠道和头颈部肿瘤等有较好疗效，最早由美国化学家Wall等[3]从喜树中提取得到；喜树碱的抗肿瘤机制在于其可以特异性地作用于拓扑异构酶I(Topo I)[4]。

喜树碱为淡黄色针状晶体固体，熔点为264～267 ℃。喜树碱不溶于水，难溶于一般溶剂，可溶于氯仿、乙醇、乙酸、乙酸乙酯；其化学性质也不同于一般生物碱，无明显碱性，大致呈中性。喜树碱的化学结构包含了一个骈列五员环；ABCD环是巨大的共轭体系，整体为平面结构(见图1)。

图1 喜树碱的化学结构

为提高喜树碱的水溶性、增强抗癌活性以及降低毒副作用，近30年来药物学家掀起了喜树碱化学修饰的热潮。喜树碱E环的内酯结构是保留其抗肿瘤活性的必要基团，对其结构改造主要涉及CPT结构中的7、9、10及20位[5-8]。研究表明，喜树碱20位羟基修饰为酯，可阻止其与内酯环羰基形成分子内氢键，从而稳定该内酯环，增强其抗肿瘤活性，例如，部分20(S)-喜树碱肉桂酸酯衍生物对胃癌SGC-7901[9]，以及20(S)-O-取代苯甲酸-7-乙基喜树碱酯类化合物对肺癌LLC-E9FP、肺腺癌95D、胃癌BGC-803、胃癌HGC-27和肝癌7721显示较强的抑制活性[10]。斑蝥素及其衍生物已被证明具有良好的抗肿瘤活性[11-12]，去甲斑蝥素是一种人工合成的抗肿瘤小分子药物，临床用于肝癌、食管癌、胃癌和贲门癌等及白细胞低下症、肝炎等。黄丹仪等[13]报道将斑蝥酸钠和喜树碱联合用药增强对肺癌细胞A549和肝癌细胞Hep3B的体外抑制作用，二者表现出协同效应。

喜树碱20位羟基形成酯后可稳定E内酯环，而喜树碱和斑蝥素两种抗肿瘤药物联用的体外协同作用已被证实。因此本研究将本实验室制备得到的去甲斑蝥素酸衍生物5-烯去甲斑蝥素单酸甲酯与喜树碱通过20位酯键连接得到的新型喜树碱20-位酯衍生物；并初步检测新型喜树碱20-位酯衍生物对肝癌HepG2、结肠癌SW480、胃癌BGC803和胰腺癌PANC-1 4种肿瘤细胞的体外抑制活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 20(S)-喜树碱(X=98%,四川成都瑞芬思生物科技有限公司)，顺丁烯二酸酐、呋喃、EDCI、DMAP (分析纯，国药集团)；石油醚、乙醚、 氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃(分析纯，重庆川东化工)；NaOH、Na2CO3(分析纯，上海化学试剂厂)；层析用硅胶( 粒度200～300目,青岛海洋化工厂)；人肝癌细胞HepG2、人结肠癌SW480、人胰腺癌PANC-1和人胃癌BGC-803细胞以及EnoGeneCellTMCounting Kit-8 (CCK-8)细胞活力检测试剂盒(南京恩晶生物科技有限公司)；蒸馏水(自制)。

81-2型暗箱三用紫外分析仪(上海司乐仪器有限公司)；Varian 400MHz核磁共振波谱仪(TMS作内标，安捷伦科技有限公司)；傅里叶红外变换光谱仪(美国Nicolet公司；KBr压片)；LC-10ATVP 型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；Thermo MK3酶标仪(美国热电公司)。

1.2 方法

1.2.1 喜树碱20-位酯衍生物3的合成 顺丁烯二酸酐与呋喃在乙醚反应通[4+2]环加成反应得到5-烯去甲斑蝥素1，1溶解于甲醇中，并在三乙胺催化作用下，醇解得到5-烯去甲斑蝥素单酸甲酯的侧链2，侧链2与喜树碱在耦合剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDCI及有机碱催化剂4-二甲氨基吡啶DMAP作用下，酯化反应得到喜树碱20-位酯衍生物3。

1.2.2 侧链5-烯去甲斑蝥素单酸甲酯2的制备[14]

1.2.2.1 5-烯去甲斑蝥素1的制备 将顺丁烯二酸酐置于干燥研钵中研细后，称取12.02 g，置于干燥的三口烧瓶中，室温下加90 mL乙醚搅拌至顺丁烯二酸酐完全溶解。缓慢滴加13 mL呋喃，滴加完毕后缓慢升温至38 ℃，继续搅拌反应1 h，溶液开始出现白色固体，且白色固体随反应时间增多。反应至24 h后抽滤，得5-烯去甲斑蝥素1。

1.2.2.2 5-烯去甲斑蝥素单酸甲酯2的制备 将4.15 g 5-烯去甲斑蝥素1悬浮于25 mL甲醇中，向悬浮液中缓慢滴加三乙胺 (0.73 mL,0.51 g)，室温下搅拌24 h，减压旋蒸除去甲醇，得到目标产物2的粗产品。将粗产品溶于25 mL二氯甲烷，依次用1 mol/L盐酸水溶液7 mL，饱和食盐水10 mL洗涤后，加入适量无水MgSO4至有机相干燥15～30 min，抽滤，滤饼用少量二氯甲烷冲洗2～3次，合并滤液，减压旋蒸去除溶剂后得5-烯去甲斑蝥素单酸甲酯2。

图2 喜树碱20-位酯衍生物3的合成

1.2.2.3 喜树碱5-烯去甲斑蝥酸酯衍生物3的制备 喜树碱1.2 g (3.48 mmol)溶于20 mL氯仿中，依次加人5-烯去甲斑蝥素单酸甲酯2(1.38 g，7 mmol)，3.2 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDCI(16.8 mmol)和240 mg 4-二甲氨基吡啶DMAP(2.44 mmol)。室温下搅拌反应10 h，TLC薄层板跟踪监测，展开剂(CH2Cl2:CH3OH=97∶3)，在紫外灯254 nm下观察，反应底物喜树碱消失。停止反应，加入30 mL氯仿，依次用蒸馏水、Na2CO3饱和溶液、饱和食盐水洗涤，有机相用无水MgSO4干燥，减压旋蒸去除溶剂后的残留物粗产品经硅胶柱层析纯化后得20(S)-喜树碱5-烯去甲斑蝥酸酯衍生物3。

1.2.3 CCK-8染色法检测体外肿瘤细胞抑制活性 取活细胞比例达90%以上的细胞进行实验。细胞增殖抑制试验采用EnoGeneCellTMCounting Kit-8 (CCK-8)细胞活力检测试剂盒。细胞消化、计数、制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液(每孔1×104个细胞)；96孔板置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h；每孔加入100 μL相应的含药物培养基，作用浓度为50 μmol/L，同时设立阴性对照组、溶媒对照组、阳性对照组，每组5复孔；96孔板置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养72 h后；每孔加入10 μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4 h，用酶标仪测定在450 nm处的OD值，计算各个化合物对人肝癌细胞HepG2、人结肠癌SW480、人胰腺癌PANC-1和人胃癌BGC-803细胞的抑制率。

T代表待测样品组、C代表生理盐水对照组和T0代表空白对照组。

2 结果

2.1 化合物结构表征

2.1.1 5-烯去甲斑蝥素1白色固体(17.46 g，86%)，熔点：122～123 ℃，Rf：0.52(石油醚/乙酸乙酯=3/1)；1H-NMR(400-MHZ,CDCl3) ：δ 3.18(s，2H)，5.47(s，2H)，6.58(s，2H)。

2.1.2 5-烯去甲斑蝥素单酸甲酯2白色固体(4.50 g,91%)。1H-NMR(400-MHZ,DMSO-d6)：δ 12.45(br,1H),6.41-6.45(m,2H),5.06(s,2H),3.64(s,3H),2.71(s,2H)。

2.1.3 喜树碱5-烯去甲斑蝥酸酯衍生物3黄色固体(1.62 g,89%)。Rf=0.50(CH2Cl2:CH3OH=97∶3)；1H-NMR(400-MHz,CDCl3)：δ 8.41 (s,1H),8.22(d,J=8 Hz,1H),7.96(t,J=20Hz,1H)，7.84(t,J=8Hz,1H),7.68(t,J=8Hz,1H),7.24(d,J=2Hz,1H),5.70(d,J=16Hz,1H)，5.42(d,J=16Hz,1H),5.29(s,2H),4.26 (q,J=16Hz,2H),2,91(d,J=28Hz,2H),2.22(m,2H),1.72(s,4H),7.24(s,1H),0.99(t,J=8Hz,3H)。13C-NMR(100-MHz,CDCl3):161.01,162.05,147.02,143.68,141.34,139.66,126.01,125.51,124.44,123.22,123.01,122.99,122.90,115.25,90.43,62.03,44.77,35.23,26.65,24.47。IR(KBr,cm-1)：λ 3 467.2(s),3 420.2(s),3 244.4(m),2 930.1(s),2 348.2(w),2 107.3(w),1 731.0(m),1 26.2(s),1 399.9(s),1 303.1(w),1 147.1(w),1 085.8(w),1 303.1(w),612.1(m)。

2.2 喜树碱5-烯去甲斑蝥酸酯衍生物3抗肝癌活性 以斑蝥素、喜树碱为阳性对照药物，测试了喜树碱20-位酯衍生物3对人肝癌细胞HepG2等4种肿瘤细胞株的体外抑制活性；在浓度50 μmol/L时,化合物3对人肝癌细胞HepG2、人结肠癌SW480、人胰腺癌PANC-1和人胃癌BGC-803的抑制率，分别为67.44%、71.96%、55.51%和73.03%(见表 1)。

表1喜树碱20-位酯衍生物3对4种体外肿瘤细胞株的抑制率(%)a

化合物HepG2SW480BGC803PANC-1溶媒对照b1.161.020.931.04斑蝥素78.0875.0475.3377.21喜树碱74.1971.0473.9573.88喜树碱20-位酯衍生物367.4455.5171.9673.03

a：样品测试浓度为5 μmmol/mL；b：溶媒为DMSO。

3 讨论

本文设计并合成得到了一类新型20(S)-喜树碱5-烯去甲斑蝥酸酯衍生物3。合成涉及2个关键步骤，制备5-烯去甲斑蝥单酸甲酯的侧链2，将此侧链与喜树碱通过20-位酯键连接得到目标产物。各步反应使用的原料价廉易得，制备简单，可操作性强；单步收率分别为：86%、91%和89%，综合收率在71%以上。综合核磁共振氢谱、碳谱和红外光谱对目标产物结构进行了表征，结果与预期结构相吻合，证实目标化合物的成功制备。

对5-烯去甲斑蝥酸喜树碱20-位酯衍生物3进行了体外抗肿瘤活性测试，测试浓度为5 μmmol/mL，实验表明衍生物3对于人胃癌细胞BGC803和人胰腺癌细胞PANC-1抑制率高达71.96%和73.03%，活性与斑蝥素及喜树碱两个阳性对照药品相当，而对于人肝癌细胞HepG2和人结肠癌细胞SW480的抑制活性略低于阳性对照。

初步体外肿瘤细胞抑制活性数据表明，设计得到的5-烯去甲斑蝥酸喜树碱20-位酯衍生物3保留了喜树碱以及斑蝥素类衍生物对肿瘤细胞的抑制活性，其对胃癌和胰腺癌细胞的高抑制率也显示出该类化合物可作为潜在抗胃癌和胰腺癌的药物候选者。后续拟喜树碱及斑蝥素类衍生物的肿瘤抑制活性范围中补充筛选更多的肿瘤细胞株的体外活性，诸如肺癌、肺腺癌、食管癌、贲门癌等；以及进一步的小鼠体内肿瘤抑制活性测试。

[1] 杨学义,朱立,孙超.喜树资源及其开发利用[J].资源开发与市场,2007,23(7):618-619.

[2] 周涛,江维克,梅旋,等.贵州喜树的分布特征及群落结构[J].贵州农业科学,2010,38(10):157-159.

[3] Wall M E,Wani M C,Cook C E,et al.Plant antitumor agentsⅠ.The isolation and structure of camptothecin，a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor from camptotheca acuminate[J].J Am Chem Soc,1966,88(16):3888-3889.

[4] Hsiang Y H,Hertzberg R P,Hecht S,et al.Camptothecin induces protein-linked DNA breaksviamammalian DNA topoisomerase I[J].J Biol Chem,1985,260(27):14873-14878.

[5] 赵军,许旋,罗一帆,等.具有抗癌活性的喜树碱类化合物的构效关系研究[J].中国药物化学杂志,2003,13(2):27-32.

[6] 牟松,罗猛,祖元刚,等.喜树碱及其衍生物结构修饰及构效关系的研究[J].中国药学杂志,2006,41(11):804-806.

[7] 代鲁平,宋春霞,邵先祥,等.抗癌药物喜树碱类衍生物的研究进展[J].中国药学杂志,2010,45(23):1813-1815.

[8] 刘丹,张龙,达飞,等.新型喜树碱类抗癌药物的研究进展[J].现代生物医学进展,2016,16(5):990-992.

[9] 段华鑫,张殊佳,周鹏.20(S)-O-喜树碱肉桂酸酯衍生物的合成及其抗肿瘤活性研究[J].有机化学,2009,29(5):724-729.

[10]高鹏,朱磊,王佳乐,等.20(S)-O-取代苯甲酸-7-乙基喜树碱酯类化合物的合成及其抗肿瘤活性[J].合成化学,2012,20(2):137-142.

[11]周杰,吴敬波.斑蝥素及其衍生物抗肿瘤研究近况[J].西南军医,2014,16(3):271-274.

[12]袁礼,钟思雨,夏新华.斑蝥素的研究现状[J].中医药导报,2017,23(3):79-82.

[13]黄丹仪,吴转斌,黄勤,等.斑蝥酸钠与喜树碱联用抗肿瘤效果的实验研究[J].中国细胞生物学学报,2014,36(11):1519-1525.

[14]王先恒,赵长阔,贾佳,等.去甲斑蝥素单酸单酯衍生物及其抗肿瘤应用[P].中国发明专利，2016：CN201610451738.9.

(编辑：谭秀荣)

Synthesis and antitumor activity of 5-ene-norcantharidin acid 20-camptothecin ester derivatives

Zhao Changkuo1,Wang Xianheng1,2,Gao Lei1,Yang Fuhong1,Bao Yujiao1,Li Chan1

(1.Department of Medicinal Chemistry,School of Pharmacy,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Clinical Pharmacy,School of Pharmacy,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo improve anticancer bioactivity of camptothecin,a new type of 5-ene-norcantharidin acid 20-camptothecin ester derivative was designed and synthesized.MethodsMaleic anhydride is cyclized with furan in ether through [4+2] cyclization addition to afford 5-ene-norcantharidin 1,which is methanolized to give 5-ene-norcantharidin monoacid monoester2.Camptothecin react with the side chain 2 to afford 5-ene-norcantharidin acid 20-camptothecin ester derivative3.Inhibition against four kinds of tumor cell lines was investigated through CCK-8 method.ResultsTarget compound3was successfully synthesized with a yield of 89%.Compared to the two positive controls-cantharidin and camptothecin,3showed good inhibition against BGC803 and PANC-1,and relative weaker inhibition against HepG2 and SW480.Conclusion5-ene-norcantharidin acid 20-camptothecin ester derivative3has been proved with a good inhibitory activity against four tumor cells tested.

camptothecin; 5-ene-norcantharidin acid; synthesis; CCK-8 method; antitumor activity

贵州省科技厅联合基金资助项目(NO：黔科合LH字[2015]7531)；贵州省卫生计划委员会中医药管管理局项目(NO：QZYY-2014-027)。

王先恒，女，博士，副教授，研究方向:新药设计与合成、临床药学研究，药事管理学等，E-mail:wangxianheng01@163.com。

R914

A

1000-2715(2017)04-0374-04

[收稿2017-06-07;修回2017-07-11]