蛇床子素通过下调TGF-β1信号通路抗野百合碱所致大鼠右心室重构

李叶丽，岳 云，吴雨婷，付 舒，杨丹莉

(遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

蛇床子素通过下调TGF-β1信号通路抗野百合碱所致大鼠右心室重构

李叶丽，岳 云，吴雨婷，付 舒，杨丹莉

(遵义医学院 基础药理教育部重点实验室暨特色民族药教育部国际合作联合实验室，贵州 遵义 563099)

目的研究蛇床子素(Ost)对野百合碱(MCT)所致大鼠右心室重构的作用，并探讨其可能的机制。方法200～220 g SD大鼠随机分为正常对照组(Control组，n=8)，模型组(Model组，n=8)，Ost低、高剂量组(Ost10、Ost20组，10、20 mg/kg，n=8)。除正常对照组外的其余大鼠均经颈背部一次性皮下注射MCT 50 mg/kg复制右心室重构模型，造模后第1天开始给药(ig，qd)。给药28 d后称大鼠体重(BW)，右室自由壁重量(RV)，计算右室相对质量(RV/BW)；通过HE染色观察右心室显微结构；透射电镜观察右心室超微结构；Western blot 检测右心室转化生长因子(TGF-β1)蛋白的表达；real time RT-PCR检测右心室结缔组织生长因子(CTGF)和纤维连接蛋白(Fn)mRNA的表达。结果与Control组相比，Model组大鼠右室相对质量明显升高(P<0.05)；右心室心肌细胞肥大畸形且排列紊乱，胞浆肿胀明显；心肌细胞线粒体肿胀，肌浆网扩张；TGF-β1蛋白的表达明显上调(P<0.05)；CTGF和Fn mRNA的表达均明显上调(P<0.05)。与Model组相比，Ost10、Ost20组大鼠右室相对质量明显降低(P<0.05)；右心室心肌细胞排列较为整齐；心肌细胞线粒体肿胀及肌浆网扩张情况均有所减轻；TGF-β1蛋白的表达明显下调(P<0.05)；CTGF和Fn mRNA的表达均明显下调(P<0.05)。结论Ost具有抗MCT所致大鼠右心室重构的作用，其机制至少部分与其下调TGF-β1信号通路有关。

蛇床子素；野百合碱；右心室重构；转化生长因子β1；结缔组织生长因子；纤维连接蛋白

心室重构主要表现为心肌细胞肥大、细胞核肥大畸形、纤维组织增生、炎性细胞浸润及转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β的过度表达等[1-2]。故抑制或逆转右心肥厚、下调TGF-β的表达等均可在一定程度上减轻右心室重构的发生。野百合碱(monocrotaline，MCT)诱导的肺动脉高压继发的右心室重构模型是公认的制备右心室重构的模型之一[3]。右心室重构及衰竭也是导致肺动脉高压患者预后差及死亡的主要原因[4-5]。故抑制右心室重构，寻找有效的防治药物具有重要意义。

蛇床子素(Osthole，Ost)又名甲氧基欧芩酚，是从伞形科蛇床属植物蛇床Cnidiummonnier(L.)Cusson的果实中提取的一种香豆素类化合物，具有抗炎、抗氧化、扩张血管、抗肿瘤、调血脂等药理作用[6-9]。已有研究表明，Ost对肾性高血压诱导的大鼠心肌肥厚具有治疗作用[10]。也有研究表明，Ost可通过下调TGF-β1的表达抗野百合碱所致大鼠肺动脉高压[11]。因此，本课题组推测Ost可能通过抑制右心肥厚、下调TGF-β1的表达发挥抗右心室重构的作用。故本研究采用MCT诱导右心室重构模型，观察Ost对该模型的影响，并分析其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠购自第三军医大学大坪医院实验动物中心，雄性，SPF级， 200～220 g，许可证号：SCXK(渝)2012-0005。

1.2 主要试剂 Ost(纯度≥98%，南京泽朗医药科技有限公司)；MCT(美国Sigma公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL+发光剂(江苏碧云天生物技术研究所)；HRP标记的GAPDH抗体(上海康成生物技术有限公司)；TGF-β1抗体(美国Abcam公司)；HRP标记的二抗(英国CST公司)；RNA 逆转录试剂盒，荧光混合物，GAPDH、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)、纤维连接蛋白(fibronectin，Fn)引物(TaKaRa 生物工程公司)。

1.3 主要仪器 Olympus BX43光学显微镜及照相系统(日本Olympus)；Mini-PROTEAN3电泳仪、Trans-Blot Turbo转印系统、CCD成像系统、real time RT-PCR 扩增仪、通用酶标仪(美国BIO-RAD公司)；RNA 逆转录仪(德国Eppendorf 公司)；透射电子显微镜(TECNAI10; Philips,Eindhoven,The Netherlands)。

1.4 分组、造模及给药 随机抽取8只大鼠经颈背部一次性皮下注射生理盐水5mL/kg作为Control组(n=8)，其余大鼠经颈背部一次性皮下注射MCT 50 mg/kg复制右心室重构模型，造模后将大鼠随机分为Model组(n=8)，Ost10组(10 mg/kg，n=8)和Ost20组(20 mg/kg，n=8)。其中，Ost10、Ost20组于造模后第1天开始给药(ig，qd)，Control组和Model组给予等量溶媒(ig，qd)。溶媒为含有0.5%吐温80的双蒸水。

1.5 右室相对质量的测定 给药28 d后称重(body weight，BW)，7%水合氯醛5mL/kg麻醉成功后分离心脏，于生理盐水中清洗干净，游离右心室壁并称取右室质量(right ventricle，RV)，计算右室相对质量(RV/ BW)。

1.6 苏木精-伊红(HE)染色 取2～3 mm右心室组织块于4%甲醛溶液中固定48h，脱水、包埋、切片，常规苏木精-伊红染色，光镜下观察并拍照记录。

1.7 右心室超微结构的观察 取右心室心尖处约1 mm3标本置于2.5%戊二醛中固定24 h后洗涤，再放入1%饿酸-磷酸缓冲液固定1.5～2.0 h(4 ℃)，脱水、包埋、染色后于透射电镜下观察并拍照记录。

1.8 Western blot 检测右心室TGF-β1蛋白的表达 取各组大鼠右心组织提取总蛋白，BCA法定量后经10%SDS-PAGE凝胶电泳分离，用电转移半干转30 min，将TGF-β1、GAPDH蛋白转至PVDF膜上，室温封闭2 h，一抗孵育16 h(4 ℃，TGF-β1按1∶400稀释，GAPDH按1：5 000稀释)，二抗室温孵育1 h，暗室曝光，采用Quantity One定量分析软件进行灰度分析。

1.9 real time RT-PCR 检测右心室CTGF和Fn mRNA 的表达 取各组大鼠右心组织， Trizol法提取总RNA，参照GenBank 中大鼠GAPDH、CTGF和Fn mRNA 的序列设计引物。各引物序列如下：GAPDH：上游5′-GGGGCTCTCTGCTCCTCCCT-3′，下游5′- AGTTCGCTGCACCCTCAAA-3′；CTGF：上游5′- CATGGTCAGGCCCTGTGAA -3′，下游5′- CACAGAACTTAGCCCGGTAGGTC-3′；Fn：上游5′-CATCAGCCCGGATGTCAGAA -3′，下游5′- GGCATTGTCGTTGAGCGTGTA-3′。根据逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA，real time RT-PCR 扩增仪按如下条件进行检测：95℃ 3 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，循环40次。以GAPDH为内参基因，荧光强度达到阈值所需的循环数(Ct值)为统计参数，基因的表达用2-△△Ct表示，相对定量法分析结果。

0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 Ost对大鼠右室相对质量的影响 如图1所示，与Control组比较，Model组右室相对质量明显升高(P<0.05)。而与Model组相比，Ost10、Ost20组大鼠右室相对质量均降低(P<0.05)。

#P<0.05 vs control；*P<0.05 vs model。图1 Ost对大鼠右室相对质量的影响(n=8)

2.2 Ost对大鼠右心室显微结构的影响 与Control组比较，Model组大鼠右心室心肌细胞肥大，结构紊乱，部分胞核宽大畸形，胞浆肿胀明显。与Model组比较，Ost10、Ost20组大鼠心肌细胞肥大、核畸形及胞浆肿胀情况均明显改善，结果(见图2)。

A：Control；B：Model；C：Ost10；D：Ost20。黑色箭头所指的是胞浆肿胀的心肌细胞，红色箭头指的是宽大畸形的胞核。图2 Ost对大鼠右心室心肌细胞显微结构的影响(心肌细胞横切面，HE×400)

2.3 Ost对大鼠右心室超微结构的影响 与Control组相比，Model组大鼠右心室心肌细胞线粒体肿胀，部分呈髓鞘样退变。与Model组相比，Ost10、Ost20组心肌细胞线粒体肿胀情况均明显减轻。结果(见图3)。

2.4 Ost对大鼠右心室TGF-β1蛋白表达的影响 与Control组比较，Model组右心室TGF-β1蛋白的表达明显升高(P<0.05)。而Ost10和Ost20组右心室TGF-β1蛋白的表达均较Model组明显下调(P<0.05)，结果(见图4)。

#P<0.05 vs control；*P<0.05 vs model。图4 Ost对右心室TGF-β1蛋白表达的影响(n=4)

2.5 Ost对大鼠右心室CTGF和Fn mRNA表达的影响 与Control组相比，Model组大鼠右心室CTGF和Fn mRNA的表达明显上调(P<0.05)。与Model组相比，Ost10、Ost20组大鼠右心室CTGF和Fn mRNA的表达均明显下调(P<0.05),结果(见图5)。

#P<0.05 vs control；*P<0.05 vs model。图5 Ost对右心室CTGF和Fn mRNA表达的影响(n=8)

3 讨论

野百合碱(MCT)是从野百合种子中提取的一种吡咯烷生物碱，经肝代谢后生成野百合碱吡咯，可诱发右心室重构。该模型是目前公认的制备右心室重构的模型之一[3]。本研究结果显示，与Control组相比，Model组大鼠右室相对质量明显升高；心肌细胞肥大且结构紊乱，部分胞核宽大畸形，胞浆肿胀明显；心肌细胞线粒体肿胀，部分呈髓鞘样退变，提示Model组大鼠出现了明显的右心室重构。与Model组相比，Ost10、Ost20组大鼠右室相对质量均降低；心肌细胞肥大、线粒体肿胀情况均明显减轻，提示Ost具有抗MCT诱导的右心室重构的作用。

在哺乳动物中TGF-β有四种亚型，分别为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β1β2。其中TGF-β1以其活性最强且在体细胞系中所占比例最高的特性成为目前研究的热点。研究表明，TGF-β1是促心肌纤维化的重要细胞因子之一，参与调节胚层发育、器官形成、细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等，可刺激成纤维细胞的增生、促进胶原合成、使心肌纤维化，心室顺应性降低，影响心肌舒缩功能等，在心室重构中发挥重要作用[12-14]。CTGF是即刻早期基因CCN 家族成员，生理状态下在人类的多种组织器官中广泛表达，病理状态下CTGF 的过度表达与疾病的发生、发展紧密相关[15]。Fn是一种非胶原性的a2糖蛋白，在人体的发育、细胞分化、迁移、信号转导等生理过程及炎症损伤修复、免疫应答、肿瘤转移等病理过程中发挥重要作用[16]。CTGF作为TGF-β1的下游因子，可促使TGF-β1发挥促增生和细胞外基质合成等作用[17]，也可在TGF-β1的诱导下参与成纤维细胞合成Fn，使细胞外基质沉积，心室重构加重。

已有研究表明，TGF-β1蛋白的表达在MCT诱导的右心室重构模型中明显升高[18]。而Ost可通过下调TGF-β1的表达抑制异丙肾上腺素所致心肌纤维化的发生[19]。本研究结果显示，与Control组相比，Model组大鼠右心室TGF-β1蛋白的表达明显升高，CTGF和Fn mRNA的表达也明显上调，提示在该模型中TGF-β1信号通路被激活。与Model组相比，Ost10、Ost20组大鼠右心室TGF-β1蛋白的表达及CTGF、Fn mRNA的表达均明显下调，提示Ost可能通过抑制TGF-β1信号通路抗右心室重构的发生。

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(编辑：谭秀荣)

Osthole reverses the right ventricle remodeling in monocrotaline-treated rats by decreasing the TGF-β1 pathways

Li Yeli,Yue Yun,Wu Yuting,Fu Shu,Yang Danli

(Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education and Joint International Research Laboratory of Ethnomedicine of Ministry of Education,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

ObjectiveTo investigate the effect of osthole (Ost) on the right ventricle(RV)remodeling in monocrotaline (MCT)-treated rats,and to explore the mechanisms.Methods200～220 g Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups,which were control group (n=8),model group (n=8),low-dose (10 mg/kg,n=8) and high-dose (20 mg/kg,n=8) of Ost treatment group.Except the control group,the other rats were given a single injection of MCT (50 mg/kg) subcutaneously to establish the RV remodeling.Then the rats in the Ost10and Ost20treatment group were administrated orally once daily from the first day after the injection to the 28th day.The rats in the control group and the model group were given the same amount of menstruum.After 28 days of administration,the body and the RV were weighed separately.RV relative weight was measured by the relative weight ratio of RV to BW.The morphological change of the RV was observed by light microscope and transmission electron microscope.The protein level of transforming growth factor (TGF-β1) was examined by western blot.The mRNA expression of connective tissue growth factor (CTGF) and fibronectin (Fn) were detected by real time RT-PCR.ResultsCompared with the control group,the RV relative weight were increased obviously (P<0.05),myocardial hypertrophy,structure disorders and mitochondrial swelling were observed in the model group.The protein level of TGF-β1 and the mRNA expression of CTGF and Fn were remarkably up-regulated (P<0.05) in the model group.However,in comparison with the model group,the RV relative weight were decreased (P<0.05),myocardial hypertrophy,structure disorders and mitochondrial swelling were improved significantly in the Ost treatment groups.The protein level of TGF-β1 and the mRNA expression of CTGF and Fn were down-regulated in the Ost treatment groups (P<0.05).ConclusionOst can resist the RV remodeling induced by MCT in rats,which may be related to decrease the TGF-β1 pathways.

osthole; monocrotaline; RV remodeling; TGF-β1; CTGF; Fn

国家自然科学基金资助项目(NO:81360498)；遵义医学院硕士启动基金项目(NO：F-773)。

杨丹莉，女，博士，教授，硕士生导师，研究方向：心血管药理学，抗炎免疫药理学，E-mail:zmuyangdanli@foxmail.com。

R961

A

1000-2715(2017)04-0383-06

[收稿2017-05-16;修回2017-07-10]