泄化浊瘀方总皂苷对痛风及高尿酸血症HK-2细胞有机阴离子转运蛋白基因表达的影响*

魏 升 王建康 蔡旭东 钟光辉

浙江省宁波市中医院 浙江 宁波 315010

泄化浊瘀方总皂苷对痛风及高尿酸血症HK-2细胞有机阴离子转运蛋白基因表达的影响*

魏 升 王建康 蔡旭东 钟光辉#

浙江省宁波市中医院 浙江 宁波 315010

泄化浊瘀方 总皂苷 痛风 高尿酸血症 HK-2细胞 有机阴离子转运蛋白 基因表达

泄化浊瘀方临床主要用于痛风及高尿酸血症（痰瘀痹阻证）的治疗，临床疗效确切。前期实验及临床研究表明[1]，其具有抑制黄嘌呤氧化酶的活性，抑制尿酸生成，促进尿酸排泄，降低血尿酸水平的作用，能明显改善痛风及高尿酸血症的临床症状。本研究以有机阴离子转运蛋白（OATs）尿酸盐转运蛋白为切入点，探讨泄化浊瘀方治疗高尿酸血症（痰瘀痹阻证）的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品：泄化浊瘀方（土茯苓30g，萆薢、薏苡仁各15g，牛膝、泽兰、泽泻、当归、桃仁、红花各10g），组方由宁波市中医院提供，药物购于浙江省立同德医院中药房。经本实验室提取、分离、纯化，得泄化浊瘀方总皂苷，含量为62.24%。

1.2 主要试剂：苯溴马隆片（德国赫曼大药厂，批号：1600695）；逆转录试剂盒（Thermo，批号：00350176）；OAT1、OAT2、OAT3引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］；荧光定量 PCR试剂盒（Promega，批号：0000163908）。

1.3 主要仪器：xCELLigence RTCA DP多功能实时无标记细胞分析仪［艾森生物（杭州）有限公司］；E-Plate 16检测板［艾森生物（杭州）有限公司，批号：20160310］；7300型实时荧光定量PCR仪(ABI公司)；TC-20细胞计数仪（Bio-Rad公司）。

1.4 xCELLigence RTCA DP实时细胞分析系统检测泄化浊瘀方总皂苷对人肾小管上皮细胞（HK-2）细胞增殖的影响：取对数生长期的HK-2细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/ml，先在E-Plate板上每孔放入50μl培养基测基线，随后加入100μl细胞悬液，置37℃、5%CO2培养箱中培养24h，xCELLigence RTCA DP实时细胞分析系统记录细胞指数（CI）。精密称取样品泄化浊瘀方总皂苷，先用二甲基亚砜（DMSO）溶解，再用培养液稀释，依次稀释得500、250、125、62.5、31.25、15.63μg/ml，DMSO终浓度≤1‰。设上述6个浓度皂苷组、正常对照组和1‰DMSO对照组，24h后加入上述不同浓度泄化浊瘀方总皂苷，每组3复孔，继续培养96h，记录CI。

1.5 实时荧光定量PCR法检测48h HK-2细胞OAT1、OAT2、OAT3 mRNA表达：取对数生长期的HK-2细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于6孔板中，3复孔，每孔2.5ml，置37℃、5% CO2培养箱中培养24h后加药，分成5组，即DMSO对照组（含1‰DMSO）、泄化浊瘀方总皂苷高剂量组（100μg/ml）、总皂苷中剂量组（50μg/ml）、总皂苷低剂量组（25μg/ ml）、苯溴马隆组（100μg/ml），继续培养48h，细胞用于提取RNA。用Trizol法提取总RNA，并测定总RNA的含量。逆转录采用10μl体系，加总RNA 0.5μg，随机引物0.2μl，按照试剂盒说明进行逆转录反应操作。采用实时荧光定量PCR相对定量分析方法（2-ΔΔCt法）进行分析。

2 结果

2.1 xCELLigence RTCA DP实时细胞分析系统检测泄化浊瘀方总皂苷对HK-2细胞增殖的影响：xCELLigence RTCA DP实时细胞分析系统连续记录120h的CI值，正常对照组和1‰DMSO对照组的细胞增殖曲线相似，表明1‰浓度的DMSO对HK-2细胞无毒性；泄化浊瘀方总皂苷500、250、125、62.5、31.25、15.63μg/ml 6个剂量组的细胞增殖曲线呈剂量相关。其中给药后24h、48h、72h的CI值见表1，正常对照组和1‰DMSO对照组的24h、48h、72hCI值均无差异，表明1‰浓度的DMSO对HK-2细胞无毒性。总皂苷500和250μg/ml组的24h CI值均显著低于正常对照组和1‰DMSO对照组（P＜0.05或P＜0.01）；总皂苷500、250、125、62.5、31.25μg/ml组的48h CI值与正常对照组和1‰DMSO对照组相比明显降低（P＜0.01），并呈剂量相关；总皂苷500、250、125、62.5、31.25、15.63μg/ml组的72h CI值均显著低于正常对照组和1‰ DMSO对照组（P＜0.01）。72h IC50为16.9μg/ml。

2.2 实时荧光定量PCR法检测48h HK-2细胞OAT1、OAT2、OAT3 mRNA表达：由表2可见，与1‰DMSO对照组相比，泄化浊瘀方总皂苷100、50、25μg/ml对OAT1和OAT3基因表达有明显的上调作用，对OAT2基因表达有明显的下调作用（P＜0.01）。

表1 泄化浊瘀方总皂苷对HK-2细胞增殖的影响（±s）

表1 泄化浊瘀方总皂苷对HK-2细胞增殖的影响（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与1‰DMSO对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别正常对照组1‰ DMSO对照组总皂苷500μg/ml组总皂苷250μg/ml组总皂苷125μg/ml组总皂苷62.5μg/ml组总皂苷31.25μg/ml组总皂苷15.63μg/ml组例数3 3 3 3 3 3 3 3 24h CI 1.619±0.299 1.651±0.094 0.556±0.055**##1.107±0.159*#1.849±0.135 1.592±0.374 1.737±0.418 1.665±0.347 48h CI 2.570±0.160 2.665±0.143 0.303±0.049**##0.417±0.091**##0.549±0.049**##1.075±0.205**##1.342±0.148**##2.628±0.458 72h CI 3.875±0.420 4.023±0.263 0.059±0.014**##0.068±0.022**##0.056±0.017**##0.264±0.072**##1.115±0.108**##2.617±0.369**##

表2 泄化浊瘀方总皂苷对HK-2细胞OATS基因相对表达水平的影响（±s）

表2 泄化浊瘀方总皂苷对HK-2细胞OATS基因相对表达水平的影响（±s）

注：与1‰DMSO对照组比较，**P＜0.01。

组别1‰DMSO对照组总皂苷高剂量组总皂苷中剂量组总皂苷低剂量组苯溴马隆组OAT3 1.000 23.358±0.408**14.271±0.151**10.880±0.396**21.539±0.227**OAT1 1.000 2.533±0.071**3.259±0.057**7.585±0.213**5.570±0.135**OAT2 1.000 0.743±0.047**0.555±0.020**0.396±0.013**2.648±0.037**

3 讨论

笔者认为痛风的病因病机乃浊毒瘀滞使然，主张痛风病诊断一经明确，治疗便应恪守泄化浊瘀方这一大法。临床常以泄化浊瘀方为基础方，取降泄浊毒与化瘀活血药物进行配伍，如此可促进浊毒之泄化，解除瘀结之机转，推陈致新，增强疗效。本研究立足于总皂苷的研究，土茯苓[2]除了含有黄酮类成分外，皂苷是其主要成分之一。另外方中的萆薢[3]，也有报道[2]其含体皂苷，包括螺甾烷皂苷、孕甾烷昔、甾体苷元等。研究发现，泄化浊瘀方总皂苷100、50、25μg/ml对OAT1和OAT3基因表达有明显的上调作用，对OAT2基因表达有明显的下调作用（P＜0.01）。OATs功能主要是转运体内内源性及外源性有机阴离子，尿酸是主要在肾小管通过OAT1和OAT3转运的一种内缘性有机阴离子。OAT1和OAT3的肾脏中表达的下调，可以产生肾脏炎症，从而减少肾脏的分泌和增加有机阴离子的积累。近年研究发现肾脏尿酸排泄减少与尿酸有机阴离子转运体有关，OATs表达及功能缺陷可能为原发性高尿酸血症重要的发病机制之一[4]。

药物及其体内的代谢产物，通过与OAT1和OAT3相互作用产生毒性，其中大部分药物是因为作为OAT1和OAT3的内、外源性底物，且相互之间存在竞争性抑制和非竞争性抑制，导致能够产生毒性的物质蓄积于体内，从而对机体造成损害。研究发现，较长时间（48h、72h）中高浓度总皂苷组CI值均显著低于正常对照组和1‰DMSO对照组（P＜0.01），对HK-2细胞产生一定毒性。两者是否存在一定关联，有待进一步证实。此外，研究发现泄化浊瘀方总皂苷可下调OAT2表达，影响OAT2活性是否能引起相应底物的药效学与药动学变化尚需要进一步研究。OAT2转运不同药物能力差别较大，临床上可观察到很多药物影响OAT2的表达与活性，但其通过何种信号通路调控研究较少，仍需进一步深入探索。

[1]魏升，伍云洲，蔡旭东，等.中西医结合治疗痛风性肾病45例疗效观察[J].中国中医药科技，2016，23（6）：718-720.

[2]徐婷婷，承志凯，尹莲，等.土茯苓抑制黄嘌呤氧化酶活性的物质基础研究[J].中药材，2012，35（4）：582-585.

[3]苏筠霞.中药“萆薢提取物”对尿酸性肾病保护作用的研究[D].兰州：甘肃农业大学，2014.

[4]Otani N，Ouchi M，Hayashi K，et al.Roles of organic anion transporters(OATs)in renal proximal tubules and their localization[J].Anat Sci Int，2016，92 (2)：200-206.

2017-03-10

浙江省中医药科技计划项目泄化浊瘀方总皂苷对黄嘌呤氧化酶活性和OATs基因表达的影响，编号：2015ZB103

# 通讯作者：钟光辉，E-mail：zgh20040712@126.com