塔里木兔人工采精技术试验研究

木沙·托合提 买买提江·阿布拉克 陈海燕 兰文旭 库尔班·吐拉克*

(1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐，830052；2.天山西部国有林管理局尼勒克分局，尼勒克，835700；3.新疆阿勒泰地区林业局，阿勒泰，836500)

塔里木兔人工采精技术试验研究

木沙·托合提1买买提江·阿布拉克2陈海燕1兰文旭3库尔班·吐拉克1*

(1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐，830052；2.天山西部国有林管理局尼勒克分局，尼勒克，835700；3.新疆阿勒泰地区林业局，阿勒泰，836500)

稿件运行过程

塔里木兔； 麻醉； 电刺激采精； 按摩采精； 解剖取精

塔里木兔(Lepusyarkandensis)中文俗名野兔、莎车兔[1]。栖息在塔里木盆地海拔900～1 200 m河流沿岸的胡杨(Populuseuphratica)和多枝柽柳(Tamarixramosissima)林中、塔克拉玛干沙漠四周的半沙漠草原和塔里木河河水泛滥地区等[2]，是在世界范围内仅分布于新疆塔里木盆地的特有兔种之一。近年来，由于开发和经济建设活动的影响，塔里木兔栖息地不断萎缩，种群数量日益下降，物种生存面临严重威胁。因此，开展其繁殖生物学研究将对其种群延续、数量恢复、有效保护与利用具有积极的作用。

兔子属于刺激性排卵动物[3]，人工授精时需要对母兔采用外源性激素或药物诱发排卵。根据相关研究报道，公母家兔自然交配按1∶5或1∶8；人工授精时，公、母兔比为1∶20～1∶30较合适[4]。草兔(Lepuscapensis)人工驯繁，公母自然交配比例为1∶4比较合适[5-6]；不宜多放，因为野兔有咬架的恶习，放多了会干扰野兔的正常交配，并且野兔的母性较差，对幼兔也会造成危害。虽然兔子自然交配配种率高，但这次实验研究，为今后的野兔人工授精工作提供参考数据，有一定的利用价值。

近年来在新疆为有效保护与利用塔里木兔资源，已建立人工驯养繁育基地并尝试将人工采精、同期发情、人工授精等多种现代动物繁殖技术应用在塔里木兔上，但由于塔里木兔个体小、野性强、许多繁殖生理特性不清楚等原因，塔里木兔繁殖技术研发进展缓慢。

人工驯养繁殖是野生动物保护，种群延续、数量恢复与利用工作中最为有效的方法之一。其中人工采精是首先要解决的技术问题，国内外已将现代动物繁殖技术应用于许多野生动物的繁殖上，并已在多种野生动物繁殖技术中取得了进展，且相继开发了野生动物采精、精液保存(建立种质资源库)及野生动物人工授精等技术，目前这些技术在陆生野生动物、水生野生动物中都有应用。

动物人工采精常用方法有：按摩采精法、假阴道采精法、电刺激采精法等。按摩采精法最初由Burrow 和Quinn首先应用于家禽和火鸡(Meleagrisgallopavo)[7]，后来被世界各地采用于貂(Martesspp.)、狐狸(Vulpesspp.)、兔等其他动物。自从苏联研究者于1931年假阴道采精法发明后，很快被广泛应用在畜牧业中。1933年由 Kardyinowich及Milowanov创造了兔假阴道和假台兔法采取精液，1938年Macirone与Walton在此基础上又作了进一步改进[8]。目前假阴道采精法多用于驯化程度较高、性情温驯的动物上。电刺激采精法由Serebrovskii和Sokolovskaja等人发明，在1934年首先应用于水禽[9]。目前，电刺激采精已运用在狼(Canislupus)[10]、东北虎(Pantheratigrisaltaica)[11]、东北马鹿(Cervuselaphusxanthopygus)[12]、林麝(Moschusberezovskii)[13]、梅花鹿(Cervusnippon)[14]、天山马鹿(Cervuselaphussongaricus)[15]、大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)[16]、黑猩猩(Pantroglodytes)[17]、非人灵长类(non-human primate)[18]等野生动物上。解剖取精法方面报道少，主要是采集附睾内的精子用于保存方法的研究[19]，以及体外受精等方面。相关报道有，褐家鼠(Rattusnorvegicus)体外受精时附睾精子优于鲜精，此后，张世生等[20]水牛(Bubalusbubalis)研究证明了附睾精子用于体外受精的可行性。陈莹莹等[21]采用手握法、电刺激法及附睾采精法采集精液，并进行精液品质分析，从而得出手握法采集精液为最佳的结论。

对于野性较强的野生动物，麻醉可以使它们达到镇定、镇静、肌肉松弛的效果，从而避免采精时动物对采集人员的伤害。目前，常用的麻醉剂有鹿眠宝、眠乃宁、水合氯醛、乌拉坦、戊巴比妥钠、陆眠宁、速眠新Ⅱ、陆眠灵、阿佛丁等。周昆等[22]在犬、猫、兔用3%戊巴比妥钠静脉注射麻醉剂量为30 mg/kg；徐春忠[23]用眠乃宁对不同动物进行麻醉，大熊猫最佳剂量为(1.45±0.20)mL/100 kg，猫科(Felidae)动物的推荐剂量是1.9～2.6 mL/100 kg，对非洲狮(Pantheraleo)剂量稍大(2.81±0.42)mL/100 kg，对熊科(Ursidae)动物的推荐剂量是1.8～3.1 mL/100 kg，狼(6.14±0.75)mL/100 kg[23]。张亚飞等[24]对犬的试验用速眠新Ⅱ，先肌肉注射0.06 mL/kg，再肌肉注射戊3% 巴比妥钠0.5 mL/kg，得到较好麻醉效果。从精液采集、麻醉效果上看，适宜不同动物的麻醉药剂量和采精方法，学术界仍有不一致的各类报道。

基于此，本试验以健康、成年塔里木兔为试验对象，采用常用不同麻醉剂(速眠新Ⅱ、戊巴比妥、乌来糖等)进行保定，采用不同采精方法(按摩法、电刺激法及解剖取精法等)进行精液采集，研究不同麻醉剂及剂量、不同采精方法对塔里木兔麻醉及采精效果的影响，为今后人工授精工作的开展提供试验参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物

由新疆乌什县塔里木兔种源繁育有限责任公司提供，健康成年纯种塔里木公兔80只，体重1 200 g左右，试验动物单笼饲养，日粮包括新鲜苜蓿草300 g/只，玉米粒30 g/只，自动饮水器饮水。

1.1.2主要仪器及药品

试验仪器：显微镜(OLYMPUS CX23)、电刺激采精仪(型号：KH-DC 北京坤恒畜牧设备中心)、数显电热水浴锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产)、电子称。

药品：速眠新Ⅱ、苏3号(吉林省华牧动物保健品有限责任公司生产)、乌来糖(乌拉坦，国药集团化学试剂有限公司20080610)、戊巴比妥钠(Sigma P3761)。

1.2试验方法

1.2.1分组设计

1.2.1.1麻醉药以及剂量的筛选

试验用公兔随机分为3组，每组20只，共60只，每种麻醉剂的每个不同剂量用5只兔子，速眠新Ⅱ按0.01、0.03、0.05、0.07 mL/kg剂量肌肉注射；3%戊巴比妥钠按0.3、0.6、0.9、1.2 mL/kg，20%乌来糖按1.0、2.0、3.0、4.0 mL/kg剂量静脉注射，记录进入麻醉所需时间，苏醒所需时间，观察麻醉状态、呼吸、心跳等情况。

1.2.1.2人工采精方法的筛选

在塔里木兔繁殖季节试验用公兔随机分为3组，每组6只，对照组采用解剖取附睾精液，试验1组采用电刺激法采精，试验2组采用按摩法采精，前2组隔3 d采1次精液，重复3次，记录采精量、精子活力、密度、电刺激电压、电流、阴茎勃起状态等。

1.2.2采精方法

1.2.2.1解剖取精

摘取成年公兔附睾后，立即送到实验室，在无菌操作室，用灭菌剪刀将包皮和睾丸鞘膜剖开剪取附睾尾部，于37℃恒温载物台上事先预热的稀释液中(稀释液2 mL)，并用无菌剪刀细切附睾尾部使精子流入稀释液中，最后在配有恒温载物台的显微镜下观察，记录精子活力及密度等各项指标。

1.2.2.2电刺激采精

电刺激采精一般3人操作，1人保定兔子，1人拨动主机开关，另1人采集精液并记录。对公兔麻醉后进行采精前的准备工作。保定员用右手持塔里木兔背部大腿基部，使两腿自然分开，左手固定头部保持头部略高于臀部，保定员用力要适度，既要使公兔安静，又要防止挣脱。采精员将备好的集精杯(本试验采用1.5 mL离心管)套在公兔阴茎上，将电刺激仪的电压调节到最小档位，将涂有凡士林的刺激棒从肛门缓慢插入6～8 cm，打开开关，由低向高慢慢调整刺激电压，每档通电时间为10 s，断电3 s，以0.1 V幅度增加电压至排精。

1.2.2.3按摩采精

所有取精用公兔提前1 d断水，公兔麻醉处理后，首先操作者按压膀胱处挤出膀胱内尿液以免尿液混入精液。然后，剪去阴茎周围的长毛，用生理盐水冲洗、擦干。采精时需要3人操作，1人一手抓公兔耳朵将兔子悬挂提起来，另一手呈八字形从腹部到睾丸方向，一松一紧地节凑性按摩，另一人将兔子后腿岔开，第3个人一手持离心管或集精杯并套在公兔阴茎上，另一手轻轻按摩睾丸和阴茎一直到排完全部精液。

1.2.3精子活力和密度的评价

采精结束后，取15 μL精液，滴于恒温载物台上预热的载玻片上，盖上盖玻片，于37℃在20～40倍显微镜下观察精子运动状态，根据多个视野的观察情况及时估计直线前进运动精子在总精子中的比例，以0～1.0的十级评分法评定精子活力，如有50%的精子做直线运动，活力计为0.5，每个样本评价3次，取平均值；精子密度的评价可采用血细胞计数板在光学显微镜下直接计数。

1.2.4统计分析

试验数据经EXCEL结果用平均数(X)。

2 结果

2.1麻药剂量及种类对塔里木兔麻醉效果的影响

由表1可见，随麻醉药剂量的增加进入麻醉所需时间缩短，而麻醉持续时间延长；速眠新Ⅱ剂量0.05 mL/kg时，麻醉所需时间(6.3±0.4)min，麻醉持续时间(47±4.5)min，进入良好的麻醉状态，剂量0.05 mL/kg时，麻醉所需时间缩短(4.0±0.5)min，麻醉持续时间延长到(62±8.5)min，进入深度麻醉状态；3%戊巴比妥钠剂量0.9 mL/kg时，麻醉所需时间(7.3±0.4)min，麻醉持续时间(63±11.5)min，进入良好麻醉状态，剂量1.2 mL/kg时，麻醉所需时间缩短到(3.2±0.8)min，麻醉持续时间延长到(102±18)min，进入深度麻醉状态；20%乌来糖剂量3.0 mL/kg时，麻醉所需时间(5.0±0.7)min，麻醉持续时间(35±7.5)min，麻醉状态良好，剂量4.0 mL/kg时，麻醉所需时间缩短到(3.0±0.5)min，麻醉持续时间延长到(95±11.5)min，进入深度麻醉状态。

表1麻药种类及其剂量对塔里木兔麻醉效果的影响

Tab.1 Effect of anesthetic on tarim rabbits using different types and dosage of anesthetics

2.2 不同方法对塔里木兔采精效果的影响2.2.1 解剖取精法

由表2可见，6只公兔精子活力之间没有较大差异，精子活力在0.70～0.85之间，平均为0.79；精子密度在78.33×107～110.67×107/mL之间。

2.2.2 电刺激法对塔里木兔采精效果的影响

由表3可见，6只公兔射精量在0.10～0.15 mL之间，平均为0.12 mL；精子活力在0.10～0.60之间，平均为0.45；阴茎勃起状态较差，精子密度在0.23×107～69.53×107/ mL，大部分精液成乳白色，部分精液伴随有尿液成乳黄色；电刺激电压0.1～3 V，平均为1.42 V，电刺激时通电10 s，断电3 s；刺激次数最高达4～60次，平均为27次。

表2 解剖取精法对塔里木兔采精效果的影响

Tab.2 Effect of semen collection on tarim rabbits by anatomy

2.2.3 按摩法对塔里木兔采精效果的影响

由表4可见，6只公兔射精量差异较大在0.10～0.2 mL之间，平均为0.15 mL；精子活力0.50～0.75，平均为0.65；多数公兔阴茎勃起状态较好，精液成乳白色，精子密度在20.33×107～69.33×107/ mL之间。

表3 电刺激法对塔里木兔采精效果的影响

Tab.3 Effect of semen collection on tarim rabbits by electrostimulation

表4 按摩法对塔里木兔采精效果的影响

Tab.4 Effect of semen collection on tarim rabbits by massage

3 讨论

3.1 麻药剂量及其种类对塔里木兔麻醉效果的影响

为合理地使用动物麻醉药最终获得理想的麻醉效果，试验中，选择安全、有效的麻醉方法是保证试验成功的重要因素。麻醉剂的浓度、剂量、种类、给药方式等对动物麻醉效果影响较大。乌拉坦是无色透明结晶，学名氨基甲酸乙酯，又名乌来糖，常用于动物的静脉注射。戊巴比妥钠是白色粉末，多用于犬、猫、兔麻醉时静脉注射。速眠新Ⅱ是一种复方制剂，具有中枢神经性镇痛，镇静和肌肉松弛作用，有着麻醉起效快、诱导期短等特点，肌肉注射。

麻醉药的说明书会告知使用量，但动物的个体存在差异，种类不同等原因，在试验中一定要用量逐渐增加。目前麻醉药在很多动物上的使用剂量并不十分清楚。陈秋羊等[25]对林麝的电刺激采用速眠新Ⅱ肌肉注射0.035～0.050 mL/kg。王相友等[26]对犬的研究速眠新Ⅱ推荐剂量为0.04～0.05 mL/kg。塔里木马鹿(Cervuselaphusyarkandensis)[27]的研究报道，半麻醉试验用量为每100 kg 体重注射鹿眠宝0.5 mL。山羊的研究报道[28]建议剂量为0.06～0.08 mL/kg(速眠新Ⅱ、肌注)。张亚飞等[24]对犬麻醉实验采用速眠新(0.06 mL/kg)待动物进入麻醉期后，再臀部肌肉注射戊巴比妥钠(3%、0.5 mL/kg)并取得了良好的麻醉效果。周小林等[29]采用速眠新Ⅱ按0.1 mL/kg臀部肌注，联合3%戊巴比妥钠0.2 mL/kg静脉注射麻醉，以及单独使用3%戊巴比妥钠按1 mL/kg静脉麻醉，得到戊巴比妥钠联合速眠新Ⅱ注射麻醉效果好的结果。陈国英等[30]乌来糖、安定、强痛定在家兔麻醉试验，25%乌来糖(4 mL/kg)加安定加强痛定成功率高，单纯使用25%乌来糖静脉注射，发现大多数家兔在实验手术时需加麻醉剂，稳定性较差。丁运萍等[31]的研究结果证实了3种不同的注射方式会得到不一样效果；肌肉注射被认定为是最方便的注射方法之一，其作用效果适中但是需要较长的时间来诱导；对于小型动物采用最多的莫过于腹腔注射，鉴于腹腔在动物体的特殊位置这种注射方式可以产生较长的时间的麻醉效果，非常适用于长时间操作的试验；静脉注射也是一种较为普遍的注射方式，然而只适用于一些特别需要静脉药物注射或者需要进行紧急麻醉时才适用此种注射方式，其原因是操作难度大，不易掌握[31]。

本试验准确称量塔里木兔体重，选用用量的下线进行预试验，并根据塔里木兔的反应，以及保定者对塔里木兔肢体力量的感应来确定是否需要添加用量。本试验单独使用不同剂量速眠新Ⅱ、3%戊巴比妥钠和20%乌来糖的麻醉效果来看，随着3种不同麻醉药剂量增高麻醉所需时间缩短，麻醉持续时间延长趋势，其中速眠新Ⅱ最佳剂量为0.05 mL/kg；3%戊巴比妥钠的最佳剂量为0.9 mL/kg；20%乌来糖为3.0 mL/kg，虽然3%戊巴比妥钠和20%乌来糖比速眠新Ⅱ麻醉持续时间较长，但注射量大、静脉注射、操作麻烦、苏醒慢、副作用大、安全性差，再加上塔里木兔体型小、性情暴烈、野性强，易受惊吓，而且静脉血管很细，很难注射麻醉药，因此，塔里木兔选用速眠新Ⅱ肌肉注射有较好的麻醉效果。

3.2 不同方法对野生动物采精效果的影响

近年，随着野生动物保护与利用的发展，一些先进的繁殖技术应用于野生动物的人工繁殖中，虽对改良品种和提高其生产性能有一定成效，但是由于对不同方法采精，精液保存方面的研究不足，进而严重制约了人工繁殖技术的研究和进一步推广应用。人工授精是保护动物资源，扩大动物品种数量的一种手段，而其首要的工作是采精。采精试验应根据动物特性采用不同的采精措施。家畜、温顺动物、驯化程度较高动物采用按摩法或假阴道法采精；而对驯化程度低，按摩反应较差的动物，采用电刺激法[32]。

国内外不同学者对不同采精方法对动物采精效果的看法不一。孔庆松等[33]人认为，狐狸的采精按摩法较电刺激法好。陈莹莹等[21]采用不同3种采精方采集精液，认为手握法采集精液最佳。赵家才等[34]针对大额牛和婆罗门牛，对电刺激法、按摩法和假阴道法3种方法的采精效果进行了比较，认为假阴道法是最好。Setioko和Hetzel[35]对ALAABIO雄鸭采精效果采用3种方法研究了精液品质与受精率，结果是假阴道方法效果最佳。Palmer[36]对肉牛研究采用直肠按摩法和电刺激法采精，认为精子形态不受采精方法的影响，但直肠按摩法精子活力、活率低于电刺激采精法。

本试验采用解剖取精法、电刺激法及按摩法采集精液，并进行了精液品质分析，本试验采精结果来看，3种采精方法均能采集到精液，解剖取精法(对照组)精子活力较高，达0.70以上，但需要屠宰公兔。与其相比按摩法采精法效果最佳，采精量达0.20 mL，精子活力达0.65以上且操作简单易行，其次为电刺激法，射精时电压为0.1～3.0 V，采精量达0.15 mL，精子活力为0.60左右。陈玉等[37]用假阴道法采集公兔精液，每次可采精液 0.2～2 mL。王亚鸣[38]测定的家兔采精量0.5～1.5 mL，Paál[39]对兔子的采精过程中采精量从0.4 mL逐渐提高达到1.0 mL，平均采精量(0.68±0.34)mL，平均精子活力达到(55.55±26.63)%与本试验结果有较大的差异，这可能是家兔老实、个体大，采精方便，采用的方法不一样等原因。

另外，公兔进行电刺激采精时，有掺杂尿液的现象。这可能是电刺激采精电压过高，刺激过度的原因。不同动物，不同个体对电流刺激强度的敏感度不同，研究报道，黑吼猴(Alouattacaraya)的电刺激采精电压为2～8 V，插入深度为9.8～14.5 cm[40]。林麝的采精电压为3～5 V[13]。盘羊(Ovisammon)的采精电压为6～8 V[41]。王柏林等对梅花鹿采精试验过程中采用4～6 V电压，插入肛门深度为20 cm[42]。黄少东[43]的报道梅花鹿电刺激电压为3～5 V。本试验结果表明，塔里木兔一般射精时电压为0.1～3 V范围内，插入深度为6～8 cm之间。阴茎勃起与射精没有相伴，也可以不勃起就射精，阴茎勃起较差。

总而言之，解剖取精法(对照组)虽然在精子活力、密度等方面效果最好，但成本太高，只能一次性采精，对优良种公兔来说，不能充分利用。按摩法精子活力、密度、阴茎勃起状态等各方面效果较好，精液成乳白色，操作简单，对兔子不会产生不良刺激。电刺激采精法采精效果不如按摩法，再者电刺激操作麻烦，另外，电刺激时电压过高、刺激强度过强等方面还存在许多问题。因此，塔里木兔按摩法采精得到的效果最佳，其次为电刺激采精。

致谢：感谢导师库尔班教授的精心指导；在试验研究期间获得新疆塔里木兔种源繁育有限责任公司的大力支持，贵公司为本研究提供了很多帮助，为此对贵公司领导及相关工作人员表示衷心感谢；衷心感谢新疆维吾尔自治区林业厅野生动物保护处处长史军的关心和支持!

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Yarkand hare； Electrical stimulation method； Anesthesia； Massage method； Anatomical semen collection method

塔里木兔(Lepusyarkandensis)为中国特有兔种，是国家Ⅱ级保护动物。近年来国内野兔需求市场日趋火爆，其巨大的经济效益，造成新疆塔里木兔偷捕盗猎、非法倒卖时有发生，并呈日益上升趋势。人工驯养繁殖是野生动物保护，种群延续、恢复种群数量与开发利用等工作中最为有效的方法之一。其中人工采精是首先要解决的技术问题。本文以塔里木兔为试验对象，采用3种麻药(速眠新Ⅱ、3%戊巴比妥钠、20%乌来糖)进行药物保定，并采用不同方法(解剖取精法、电刺激法、按摩法)进行精液采集，探索适合塔里木兔的麻药种类、剂量和采精方法。结果表明，3种麻醉药物均能有效诱导麻醉，其中速眠新Ⅱ(0.05 mL/kg)的麻醉效果最佳，其次为3%戊巴比妥钠(0.9 mL/kg)，20%乌来糖(3.0 mL/kg)。本试验采用的3种采精方法来看，3种采精方法均能采集到精液，解剖取精法(对照组)精子活力较高，达0.70以上，但需要屠宰公兔。与其相比，按摩法采精法效果最佳，采精量达0.20 mL，精子活力达0.65以上且操作简单易行；其次为电刺激法，射精时电压为0.1～3.0 V，采精量达0.15 mL，精子活力为0.60左右。

Experimental Study of Semen Collection from Captive Yarkand Hare

Musha Tuoheti1Maimaitijiang Abulake2Chen Haiyan1Lan Wenxu3Kuerban Tulake1*

(1.College of Animal Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，830052，China；2.Nilka Branch Station，Forestry Administration Bureau of Western Tianshan，Nilka，835700，China；3.Forestry Bureau of Altay Prefecture，Altay，836500，China)

Yarkand hare is endemic to China，and listed as a second-class national protected species.In recent years，domestic market demand for wild rabbit has increased and the resulting potential for economic benefit has led to increasing levels of poaching and illegal trade of Yarkand hare.Domestication and captive breeding is one of the most effective ways for wildlife protection，population maintenance and recovery，and exploitation.Semen collection is one of the first technical problems to be solved in captive breeding.We evaluated 3 kinds of anesthetic drugs (sumianxinⅡ，3% pentobarbit and 20% Urethane)used to sedate Yarkand hare，and 3 methods (massage，electrical stimulation，and anatomical semen collection)to collect semen.The results showed that 3 kinds of anesthetic drugs can effectively induce anesthesia，in which Sumianxin II (0.05 mL/kg)has the best anesthetic effect，followed by 3% sodium pentobarbital (0.9 mL/kg)，and 20% ethylurethanm (3.0 mL/kg).The test results showed that semen can be collected effectively by using 3 kinds of semen collection methods.Sperm motility of semen collected by anatomical method (control group)was the highest (over 0.70)，but the disadvantage of this method was that male rabbits had to be slaughtered.The massage method was more suitable and easy to operate，and yielded semen volume up to 0.20 mL，with sperm motility over 0.65.By electrical stimulation，semen volume reached 0.15 mL with sperm motility of about 0.60，with voltage at 0.1-3.0 V for ejaculation.

新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2013211A029)；横向课题(塔里木兔快繁技术研发)

木沙·托合提，男，26岁，硕士研究生；主要从事动物遗传育种与繁殖研究。E-mail：1350896482@qq.com

*通讯作者：库尔班·吐拉克，E-mail：kturak@sina.com

2016-11-09

S865.42

A

修回日期：2017-01-29

发表日期：2017-05-10

2310-1490(2017)02-215-07