通过式固相萃取结合超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱筛查鱼肉中多类兽药残留

李佩佩，张小军，张 帅，严忠雍，陈 思，方 益，龙 举

（浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山 316021）

通过式固相萃取结合超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱筛查鱼肉中多类兽药残留

李佩佩，张小军，张 帅，严忠雍，陈 思，方 益，龙 举

（浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山 316021）

采用通过式固相萃取技术作为样品净化方法，液相色谱-四级杆/飞行时间质谱（HPLC-Q-TOF/MS）作为检测手段，建立了水产品中磺胺类、β-内酰胺类、头孢类、苯并咪唑类衍生物、氟喹诺酮类等37种兽药的高通量快速筛查技术。样品经80%乙腈水溶液提取，Oasis PRiME HLB固相萃取小柱通过式净化，分析物经Waters ACQUITY UPLC BEH C18反相柱分离，以0.1%甲酸水溶液-乙腈作为流动相梯度洗脱，电喷雾正离子模式检测，以保留时间、化合物精确分子离子质量和特征碎片离子质量对药物进行定性定量分析。37种兽药在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数大于0.98，定量限为5.0～50 μg/kg，3个加标水平下的平均回收率为66.2%-86.5%，相对标准偏差（RSD，n=5）均小于15.0%。本方法前处理简单，检测快速高效准确，适用于实际水产品中多种兽药的筛查和确证。将建立的方法应用于农业部水产品风险监测、浙江省风险监测和舟山市投入品筛查等的兽药残留的筛查工作中，筛查出一例利福平残留和一例红霉素残留。

兽药残留；通过式固相萃取；超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱；鱼肉

目前，添加不同类别和功效的“复合抗生素”、使用新型兽药代替重点监管种类、将人用抗生素添加到水产品中等行为导致了水产品中兽药残留问题愈加复杂。兽药残留不仅会污染环境，更会通过食物链的富集作用最终危害人体健康[1-2]。目前的水产品抽查仅针对几种常用兽药进行定量检测，对于不常用的种类很少关注，虽然有些风险监测项目新增了可能使用的兽药品种，但检测方法仍以分类定量检测为主[3-10]，费时费力，效率不高，不能实现水产品中多种兽药的全面快速筛查。三重四级杆质谱具备检出限低和灵敏度高等优势，可同时定量测定几类药物，但不能对化合物进行精确相对分子质量和断裂途径的测定。四级杆-飞行时间质谱属于高分辨质谱，能测定得到精确质量数（精确到小数点后4位），还可通过数据库进行一级和二级质量数匹配以确证化合物的存在[11-14]。在实际应用中，可以先利用UPLC-QTOF-MS对多种药物开展高通量筛查，在大量样品中排查出兽药，然后再利用UPLC-MS/MS对结果进行准确定量确证。这样的技术路线可以大大缩短样品分析时间、减少人力物力消耗、提高检测效率。

水产品中富含脂肪、磷脂、蛋白等基质干扰物质，样品前处理直接影响检测结果。目前水产品中抗生素残留检测的净化方法主要采用HLB固相萃取法[3,7,9]、QuEChERS方法等。有别于现有方法，本文采用的通过式固相萃取技术，以Oasis PRiME HLB柱净化样品，上样前无需活化和平衡，直接将样品溶液加载到SPE柱上，比传统的SPE柱操作简便。其填料是一种反相固体萃取吸附剂，是在水可浸润性Oasis吸附剂为基础而特殊设计的一种SPE。目前通过式固相萃取方法在筛查和快速检测水产品中全氟化合物、青霉素等药物中有良好的吸附脂肪和磷脂类化合物等杂质和富集效果[15-16]。在保证净化效果的同时简化了前处理步骤。本文通过建立的筛查数据库，可以对目标未知化合物进行快速筛查与鉴定。将方法应用于筛查实际样品，筛查出的兽药再通过液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）进一步定量分析，可保证结果的可靠性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

41种标准品包括磺胺喹恶啉、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺二甲异恶唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺对甲氧基嘧啶、磺胺吡啶、双氯西林、萘夫西林、青霉素V钾、氨芐西林、头孢匹罗、头孢氨芐、头孢哌酮、头孢喹肟、头孢噻呋、诺氟沙星、依诺沙星、达氟沙星、沙拉沙星、麻保沙星、司帕沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、双氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、恶喹酸、氟甲喹、萘啶酸、红霉素、利福平、甲苯达唑、阿苯达唑均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司（纯度为98.5%-99.0%）；乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯；试验用水为Milli-Q超纯水。

准确称量各标准样品10.0 mg,置于10 mL容量瓶中，根据各类兽药的化学性质，用乙腈或者甲醇溶解并定容，配制成质量浓度为1 mg/mL的储备液，置于-18℃保存，部分不易溶解的氟喹诺酮类物质先用少量甲酸溶解，再加乙腈稀释定容。各标准储备液临用时取出，待其恢复至室温时依据需要用水稀释成适宜浓度的工作液。

1.2 仪器与设备

Waters Acquity超高效液相色谱仪-高分辨-四级杆-飞行时间质谱仪（Waters Xevo G2-S QTof-MS）（美国Waters公司）；AcquityTM型超高效液相色谱仪（UPLC，美国Waters公司）；Quattro Premier XE串联四极杆质谱仪（美国Waters公司）；T18匀浆机（德国IKA公司）；IKA MS2漩涡混合器（德国IKA公司）；Centrifuge 5810高速离心机（德国Eppendorf公司）；VisiprepTMDL固相萃取装置（美国Supelco公司）；NEVAP112氮吹仪（美国Organomation公司）；0.22 μm过滤膜（美国Waters公司）；Waters Oasis PRiME HLB固相萃取柱（6 mL，500 mg）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

鱼肉样品（草鱼、鲤鱼、大菱鲆、大黄鱼、乌鳢、罗非鱼等）来自于河南、上海、温州、舟山等地的水产品批发市场和农贸市场，按照SC/T 3016的规定处理后于-18℃密封保存。使用前先解冻。

取均质好的样品2.0 g于15 mL聚丙烯（PP）离心管中，加入80%乙腈水溶液6 mL，旋涡振荡2 min，超声提取5 min，8 000 r/min高速离心5 min，移取上清液至10 mL比色管中，用80%乙腈水溶液定容至8 mL。取4 mL上清液直接加载到PRiME HLB固相萃取柱上，控制流速为1滴/s。准确移取3 mL流出液在45℃水浴下氮气吹至小于0.6 mL，残留液体用10%乙腈水溶液定容至1.00 mL，过0.22 μm微孔滤膜，上机测试。

1.3.2 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流动相 A 为 0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈。流量0.45 mL/min。柱温40℃；进样量3 μL。梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program of mobile phase

1.3.3 质谱条件

离子源:电喷雾正离子源；扫描模式为Full Scan/MSE；检测方式:多反应监测（MRM）；毛细管电压为3.0 kV；锥孔电压为35 V;离子源温度为120℃；脱溶剂气温度为380℃；锥孔反吹气为高纯氮气，流速为50 L/h；脱溶剂气为高纯氮气，流速为600 L/h；运行时间为15 min。Source Acquisition Mode、Da Range及Collision Energy根据37种兽药的特性选择调试合适的条件，低碰撞为0 V，高碰撞能为20-30 V；质量扫描范围为100-1 000 Da；采用2.0 μg/L亮氨酸脑啡肽（分子量为556.277 1/554.261 5（+/-））进行实时校准以保证目标物的质量数精度。

2 结果与讨论

2.1 筛查数据库的建立及分析

配制各兽药标准溶液，在优化好的色谱-质谱条件下进样,采用全扫描模式对每一种目标化合物的标准品在不同的碰撞电压下进行进行MS/MS扫描，收集母离子和子离子的碎片信息。采用MassLynxChromlynx软件建立抗生素的筛查数据库。表2列出了筛查数据库中化合物的名称、分子式、母离子、保留时间和质谱碎片离子信息。各个物质的的准分子离子峰的提取范围为±0.005 Da，保留时间偏差范围设为小于0.3 min。通过比对实测和数据库中目标物的保留时间、精确相对分子质量、同位素峰形即可进行快速准确筛查。根据欧盟2002/657/EC决议[17]规定高分辨质谱需满足4.5分的评分标准，检测到1个具有精确质量数的母离子获得2个确证分数，二级质谱中的每个子离子获得2.5个确证分数。因此本实验选取1个母离子和1个特征碎片离子则可以满足确证要求。为验证筛查方法的可靠性，向空白鱼肉样品中加入37种目标化合物的标准溶液后按照1.3.1前处理后上机测试。加标水平为50 μg/kg。结合本文建立的数据库，37种兽药均能被确证。图1是鱼肉中添加37种目标物的提取离子流图。

图1 37种兽药标准溶液的提取离子流图Fig.1 High resolution extracted ion chromatograms of 37 veterinary drugs

表2 37种兽药的分子式、保留时间、精确分子量以及质谱碎片离子信息Tab.2 Formulas,retention times,exact molecular weight and MS fragmentation data of 37 veterinary drugs

2.2 色谱条件的优化

分析物中大部分为极性化合物，实验选取适用范围广的ACQUITY UPLC BEH C18柱进行分离。由于筛查涉及的抗生素种类多，采用适用范围广的流动相组成。采用ESI+源，选择0.1%甲酸水溶液和乙腈作为流动相。水相中加入甲酸可明显改善酸碱化合物的峰形，提高响应强度；分析物在乙腈中的离子化效率和灵敏度高于甲醇。良好的色谱分离条件能够尽可能分离多种物质，使质谱在合适的扫描频率范围内得到最佳灵敏度，本实验优化的梯度洗脱条件见表1。37种分析物在12 min内出峰，峰形较为尖锐。

2.3 前处理的优化

鉴于筛查涉及到多种结构性质不同的抗生素，因此需要一种相对通用的提取溶剂。乙腈、甲醇、乙酸乙酯是比较常见的提取试剂。乙酸乙酯提取物油脂含量较高，甲醇的提取液浑浊，乙腈具有一定的蛋白沉淀作用，盐析效果相对较好，相比其他两种溶剂提取物更干净，有利于Q-TOF-MS分析。这个和很多研究选择乙腈一致[3,12]。有些种类的抗生素具有亲水性，因此向乙腈中加入适当比例的水适合多种抗生素的提取。实验比较后发现80%乙腈水溶液作为提取液时既能使多目标物质的回收率在60%以上，又满足Oasis PRiME HLB柱通过式净化方式对高比例有机相的要求。Oasis PRiME HLB柱净化能力优于HLB柱，采用通过式净化模式，无需淋洗和洗脱步骤，直接过柱。不仅有效净化了样品提取液，而且提高了前处理效率。实验通过综合比较上样量对样品回收率的影响和Q-TOF-MS的仪器检测灵敏度，确定了最佳上样量。分别取2 mL、3 mL、4 mL、5 mL提取液直接过柱，接住流出液氮吹上机检测计算回收率。结果表明，上样液分别为2 mL、3 mL和4 mL时目标物的回收率可达到90%以上，而上样液为5 mL时目标物回收率低于85%，且部分样品过柱速度缓慢。此时提取液中所含杂质过多引起堵塞。为了尽量保证较低的稀释倍数，提高方法的灵敏度，选择4 mL提取液过柱净化。

2.4 方法学验证

对于水产品等基质复杂的样品，普遍存在的基质效应影响测定结果精密度和准确度。本研究通过配制基质匹配工作溶液来消除基质效应的影响。分别采用空白草鱼、大黄鱼、罗非鱼样品制作基质提取液和加标回收实验，根据目标药物在质谱中响应的强弱加入不同浓度的混合标准系列，得到每种物质的线性范围及相关系数。每个加标浓度平行测定5次，按本方法进行检测，得到回收率为66.2%～86.5%，相对标准偏差（RSD）为4.52%～10.1%;按信噪比（S/N）大于等于 10 计算定量下限（LOQ）为 5.0～50 μg/kg。草鱼中 37种兽药的方法学实验结果见表3。

2.5 实际应用

将本文建立的方法应用于风险评估项目的抗生素筛查中。采集大黄鱼、锯缘青蟹、鲈鱼、美国红鱼、青蟹、梭子蟹等水产品种共50批次样品。利用筛查软件以±0.05 Da的质量范围提取化合物的准分子离子峰，保留时间偏差范围设为小于0.3 min。结果在大部分样品中未检出37种目标化合物。在一个样品中筛查出利福平残留，在一个样品中筛查出一例红霉素残留。筛出红霉素药物样品的总离子流图如图2。将阳性样品的二级质谱图和红霉素标准溶液的二级质谱图（图3）相比较，两者除母离子m/z 734外,均有4个碎片离子m/z 576、558、522和158，碎片离子分子量的偏差均小于30 mDa。根据欧盟2002/657/EC的规定可以对红霉素进行定性。为获得精确的含量，再对样品进行液质法测定精确含量。按照GB 29684-2013方法，经测定红霉素含量为400 μg/kg。

图2 筛查出红霉素药物的样品的总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatograms of erythromycin from sample

图3 红霉素在溶剂（a）和在样品（b）中的MS/MS质谱图Fig.3 MS/MS spectra of erythromycin in solvent(a)and sample(b)

表3 37种兽药的线性范围、相关系数、回收率、相对标准偏差、定量限Tab.3 Linear ranges，correlation coefficients(r),recoveries，relative standard deviations and limits of quantitation(LOQ)of 37 target compounds

3 结论

本实验建立了乙腈/水提取，PRiME HLB柱净化，飞行时间质谱法高通量筛查水产品中多种抗生素和兽药残留的技术方法。与其它高通量筛查方法相比，由于采用了通过式固相萃取净化，整体实验操作更简便，耗时更短，而方法回收率和精密度等参数和其他方法一致。依据优化好的条件建立了药物精确质量数据库。通过基质标准曲线校准，外标法定量完成了实际样品中药物的筛查、确证与定量。本方法前处理简便，确证准确，适用于大批量样品中多种兽药的快速筛查。可为保障水产品质量安全提供技术支持。

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[17]European Commission.Commission Decision 2002/657/EC Implementing Council Directive 96/23/EC Concerning the Performance of Analytical Methods and Interpretation of Results 2002[Z].2002.

Screening and Confirmation of Multi-classes of Veterinary Drug Residues in Fish Muscle by Pass-Through SPE Purification and Ultra Performance Liquid Chromatography Coupled with Quadrupole/Time of Flight Mass Spectrometry

LI Pei-pei,ZHANG Xiao-jun,ZHANG Shuai,et al
（Marine and Fishery Research Institute of Zhejiang Ocean University,Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Province,Key Lab of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Resource of Zhejiang Province,Zhoushan 316021,China）

A method was developed for the rapid high-throughput screening of 37 veterinary drugs(including sulfonamides,β-lactam-antibiotics,cephalosporins,dibenzimidazole derivatives,quinolones)in aquaticproducts by solid phase extraction and liquid chromatography coupled with quadrupole/time of flight mass spectrometry(HPLC-Q-TOF/MS).The sample was extracted with acetonitrile-water(8:2,V/V),cleaned up by solid-phase extraction using Oasis PRiME HLB column.Then 37 target compounds were separated on a Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 column (100 mm×2.1 mm,1.7 μm).In the process of quantification and qualification,37 drugs were detected under positive electrospray ionization(ESI+)based on retention time,accurate mass and fragmentions information.The separation were achieved by using gradient system consisting of 0.1%formic acid (V/V)-acetonitrile as the mobile phase.The linear ranges of the drugs were in good linearity with the correlation coefficients greater than 0.98.The limits of detection (LOD)were from 5 to 50 μg/kg.At the different spiked levels,the average recoveries were from 66.2%to 86.5%with the relative standard deviations (RSD)less than 15%.With high speed and sensitivity,this novel approach was suitable for the highthroughput and rapid screening analysis of veterinary drugs in aquatic products.The method has been applied to several projects for quality safety risk monitoring of aquatic products,and 2 kinds of veterinary drugs were detected.

veterinary residues;pass-through solid phase extraction;UPLC-Quadrupole/time of flight mass spectrometry;fish muscle

O657.63

A

1008－830X(2017)03－0228－07

2017-03-04

浙江省科技计划公共服务项目（2016F30022）；浙江省自然科学基金（LY17C200009）

李佩佩（1986-），女，安徽宿州人，工程师，研究方向：渔业环境监测和水产品质量安全.E-mail:liwanzhao999@163.com

张小军，男，高级工程师，博士，研究方向：水产品加工与质量安全.E-mail:xiaojun3627@163.com