高灵敏荧光定量PCR技术在乙肝患者中的应用分析

陈荣华 李勤光 赵敏 柳丽娟

高灵敏荧光定量PCR技术在乙肝患者中的应用分析

陈荣华 李勤光 赵敏 柳丽娟

目的研究高灵敏荧光定量PCR技术在乙肝患者中的应用效果。方法现研究选取的研究对象为2016年10月—2017年6月在我院进行治疗的乙肝患者923例和同期在本院进行体检的健康体检者200例。使用高灵敏荧光定量PCR技术检测两组受检者。结果不同血清标志物阳性乙肝患者的HBV-DNA拷贝数差异存在统计学意义（P＜0．05），阳性率分别为35．97%、57．96%、6．07%，乙肝患者间进行比较差异具有统计学意义（P＜0．05）。结论采用高灵敏荧光定量PCR技术可较好的诊出乙肝，还可监测治疗过程及评价药效。

乙肝；高灵敏荧光定量PCR技术；应用效果

乙肝指的是乙肝病毒检测为阳性且病程在半年以上的病症[1]，以恶心、乏力、腹胀、畏食、肝区疼痛为主要临床症状[2-3]，病情严重的患者持续存在肝功能异常、脾大、蜘蛛痣等表现。乙肝患者若未得到及时、有效的治疗，会向肝纤维化、肝硬化、原发性肝癌进展[4]，故此尽早诊治乙肝具有十分重要的意义。现旨在探讨高灵敏荧光定量PCR技术（荧光定量聚合酶链式反应）应用在乙肝患者乙肝病毒检测中的效果，从我院收治的乙肝患者中抽取923例和同期健康体检者200例作为对象展开研究，报道如下：

1 资料和方法

1.1 资料

研究对象：我院2016年10月—2017年6月收治的乙肝患者923例、同期在本院进行体检的健康体检者200例。乙肝患者均与中国2010版“慢性乙型肝炎防治指南”的慢性HBV感染的诊断标准相符合。

乙肝组：男性患者714例，女209例，年龄12～89岁，平均（37.20±5.94）岁。

健康组：男性患者112例，女性患者88例，年龄12～87岁，平均（37.83±5.76）岁。

两组受检者之间对比基线资料差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

仪器选用罗氏的cobas AmpliPrep 自动核酸提取仪和cobas TaqMan 48 PCR扩增仪。采集两组受检者的清晨空腹静脉血5 ml，进行离心，取离心后的血浆650 μl在cobas AmpliPrep 自动核酸提取仪配套的样本管中，并在仪器上记录好样本编号，在对仪器进行常规的维护保养之后，检查仪器状态为正常的情况下开始样本的自动提取过程。整个提取过程大概为1 h。提取结束后，cobas AmpliPrep 自动核酸提取仪已经将提取好的核酸上清液与PCR反应混合液、耐热聚合酶（Taq酶）以及内标等全部混匀并收集在同一个扩增管（K管）中。将放置有K管的托盘小心转运至cobas TaqMan 48 PCR扩增仪，完成核酸的扩增过程。扩增仪循环参数设置为95℃预变性2 min，94℃、55℃、72℃的保持时间分别为8 s、40 s、55 s，在经过40次循环后增加40℃恒温时间（2 min）。在扩增结束后观察每管的内参是否有扩增，确保了实验的真实有效后，将扩增后的测定值测出后，从标准曲线上得出标本中的DNA拷贝数，阴性结果作为对照。

1.3 观察指标

观察两组受检者经高灵敏荧光定量PCR技术检查血清标志物检出情况，其中1、3、4、5分别代表乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎E抗原、抗-Hbe、抗-Hbc。同时观察乙肝患者的HBV-DNA拷贝数情况。

1.4 统计学处理

将本文数据录入到SPSS 20.0软件进行统计处理，计数资料（血清标志物检出情况）采用（%）表示，采用χ2检验，计量资料（HBV-DNA拷贝数）采用表示，采用t检验。P＜0.05，差异有统计学意义。

2 结果

检查结果显示，乙肝组患者的血清标志物情况均为阳性，健康组均为阴性；乙肝组中血清标志物不同阳性检出情况的HBVDNA拷贝数对比差异存在统计学意义，t=673.62，P=0.01。见表1。

表1 对比两组受检者的血清标志物情况和HBV-DNA拷贝数情况

3 讨论

乙肝出现的直接原因为乙型肝炎病毒感染，另外家族性传播、婴幼儿期感染病毒、缺乏预防意识、漏诊、既往有其他肝病史感染病毒等也是乙肝的主要发病原因。乙肝的传染源为乙型肝炎患者和乙型肝炎病毒携带者，乙肝的潜伏期为6周～6个月，乙型肝炎病毒的传播途径包括血和血液制品传播、母婴传播、性接触传播、经破损的皮肤黏膜传播[5-6]，具有较强的传染性，感染乙型肝炎病毒后，受多种因素的影响，患者会出现不同的乙肝类型。尽早对诊断乙肝，有利于及时采取有效的治疗措施控制病情进展，控制传染源，促进预后效果的提高。

在临床诊断乙肝中，通常检测的指标为天门冬氨酸氨基转移酶、胆红素以及乙肝病毒标记物、血清HBV-DNA。近年来生物技术的不断发展和进步提高了乙肝病毒快速检测技术的水平，以往检测乙肝病毒的方法包括酶联免疫吸附测定法（ELISA）和普通定量PCR技术等，其中ELISA法主要依靠抗原抗体的特异性反应检测乙肝患者血清中的HBV-M，能够将患者目前一段时间内体内病毒的免疫学反应显示出来，但ELISA法检测乙肝病毒的精确度有限；普通定量PCR技术是微量核酸扩增的有效工具，在病毒、细菌病原体及遗传病、肿瘤的早期诊断中应用广泛，具有较高的灵敏性和特异性，可检测病毒或肿瘤的治疗过程，调控机体基因表达，但其存在不能定量和判断污染所致的假阳性情况[7]；本次研究中使用的高灵敏荧光定量PCR技术与普通定量PCR技术相比存在的不同之处在于其PCR的指数曲线为S形，不为标准的增高曲线，而且每一个扩增管都为单一的标准对照，在很大的程度上排除了孔间差异（普通定量PCR技术一般为金属浴加热，受加热不均匀的影响，每管的实际温度差异直接导致了扩增效率的不一致）对结果的影响。相对而言高灵敏荧光定量PCR技术的精确度更高。

高灵敏荧光定量PCR技术是一种在DNA扩增反应中以荧光化学物质测量每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。荧光定量PCR技术的基本原理为依据荧光能量的转移定量分析DNA分子，对信号引物DNA分子的2条链进行标记，2条链在配对互补时会形成双链结构，进而出现荧光，在双链结构被破坏变为单链时，荧光会消失，根据荧光强度的变化可得出DNA定量检测结果。临床中荧光定量PCR技术一般使用荧光探针和荧光染料作为荧光化学物质，其方法有特异类和非特异类之分，特异类检测方法指的是利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针检测PCR反应的产物；非特异类检测方法指的是在PCR反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料与DNA双链特异性掺入后发射出荧光信号。两种方法各具优势。

高灵敏荧光定量PCR技术在多种病原微生物的定量检测中应用广泛，优点包括以下几点：（1）荧光标记的DNA探针特异性与病原微生物DNA全长进行杂交，可增强特异性，使假阳性率降低[8]。（2）高灵敏荧光定量PCR技术检测产物以PCR产物中的荧光信号为准，可进行实时动态检测，具有较高的灵敏度和很宽的定量范围，HBV-DNA、定量准确度可达到0～1×1011拷贝/m1、100%，临床诊断的需要能够被满足。（3）高灵敏荧光定量PCR技术在密闭的环境下进行检测，在实施PCR后无需实施处理和冗长的电泳检测，可使实施中的交叉污染减少，促进检测精确度的提高。（4）高灵敏荧光定量PCR技术的检测下限远优于普通荧光定量PCR技术，检测下限可达到20 IU/ml，普通荧光定量PCR技术的检测下限一般为500 IU/ml，高灵敏荧光定量PCR技术，检测下限可达到20 IU/ml。高灵敏荧光定量PCR技术具有特异性高、灵敏度高以及结果得出速度快的优点，在检测乙肝病毒中可通过DNA体外扩增技术定量检测患者血清中的HBV-DNA病毒载量，对乙肝患者血液内病毒的复制情况进行明确，其还能有效反映HBV自身拷贝数、HBV的感染和恢复情况，为临床治疗的效果、预后效果进行评价，有利于临床及时调整抗病毒治疗方案，促进临床治疗效果的提升。

在本次研究中，923例乙肝患者经荧光定量PCR技术检测后发现，乙型肝炎表面抗原、HBeAg、抗-Hbc阳性乙肝患者为332例（35.97%），其HBV-DNA拷贝数为（3 018.74±60.65×105个/μl），HBV-DNA水平高；乙型肝炎表面抗原、抗-Hbe、抗-Hbc阳性乙肝患者为535例（57.96%），其HBV-DNA拷贝数为（60.62±28.53×105个/μl），HBV-DNA水平低，；HBsAg、抗-Hbc阳性乙肝患者为56例（6.07%），血清中未检出HBV-DNA。研究数据说明高灵敏荧光定量PCR技术能够较好的发现阳性乙肝患者血清中的HBV-DNA，且拷贝数会随着患者血清阳性率的降低而减少。健康体检者的HBV-DNA水平均为阴性，且不存在拷贝数，说明高灵敏荧光定量PCR技术可有效检测出乙肝病毒。

乙肝患者体内HBV-DNA载量和HBeAg含量可作为病毒复制的有效指标，高灵敏荧光定量PCR技术所得出的检测结果能够对机体免疫反应所致肝脏损伤进行判断，还可早期诊断乙肝、判断乙肝传染性，有助于制定抗病毒治疗方案和筛选药物，另外还能评价药物的疗效（主要是乙肝病毒数量的增加来进行判断），以便临床治疗方案的及时调整，提高临床治疗效果的同时提高预后效果。

总之，在检测乙肝病毒中，高灵敏荧光定量PCR技术的优势明显，不仅能够为临床治疗方法的选择进行指导，其临床数据还能够帮助医生及时掌握患者的病情变化以及药物的治疗效果，有助于提高患者的生存质量。

[1] 王秀琴． 荧光PCR检测乙肝病毒DNA的临床意义[J]． 中国社区医师（医学专业)，2012，14（14）: 272．

[2] 汪圣强，耿合员，殷鹏飞，等． 实时荧光PCR在乙肝病毒DNA检测中的临床意义[J]． 中国医学工程，2015，14（3）: 29-30．

[3] 赖新华，吕娜，彭艳辉． 实时荧光定量PCR对乙肝DNA检测的影响因素[J]． 中外医学研究，2014，12（5）: 63-64．

[4] 朱明岩，叶英． 不同荧光定量PCR技术在乙型肝炎病毒检测中的应用评价[J]． 安徽医药，2016，20（9）: 1723-1726．

[5] 林森，易荣． 实时荧光定量PCR对乙肝DNA检测的影响因素[J]．国际检验医学杂志，2012，33（1）: 127-128．

[6] 魏颖． 实时荧光定量PCR对乙肝DNA检测的影响因素[J]． 求医问药（学术版），2012，10（12）: 373．

[7] 沈刚． 实时荧光定量PCR对乙肝DNA检测的影响及管理[J]． 医院管理论坛，2015，32（5）: 30-31，48．

[8] 王海峰． PCR与ELISA检测乙肝病毒的对比及临床意义[J]． 菏泽医学专科学校学报，2014，26（2）: 12-13，48．

The Analysis of Application of High Sensitive Fluorescence Quantitative PCR Technique in Hepatitis B Patients

CHEN Ronghua LI Qin’guang ZHAO Min LIU Lijuan Institute of Liver Diseases, Mengchao Hepatobiliary Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou Fujian 350025, China

ObjectiveTo study the effect of high sensitive fluorescence quantitative PCR in patients with hepatitis B.Methods923 cases of hepatitis B patients treated in our hospital from October 2016 to June 2017, and 200 patients who had physical examination in our hospital during the same period were selected into the study. Two groups of patients were detected by high sensitive fluorescence quantitative PCR.ResultsThere were differences in HBV-DNA copy number (P＜ 0.05), and the positive rate was 35.97%, 57.96% and 6.07%, and the difference between hepatitis B patients was signifcant (P＜ 0.05).ConclusionHigh sensitive fuorescence quantitative PCR technique can be used to diagnose hepatitis B, it can also monitor the treatment process and evaluate the effcacy.

hepatitis B; high sensitive fluorescence quantitative PCR technology; application effect

R446

A

1674-9316（2017）18-0104-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．18．054

福州市卫计生科技计划项目（2016-S-wt9）

福建医科大学孟超肝胆医院肝病研究所，福建 福州 350025通信作者：柳丽娟